Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Газохроматографический анализ производных аминокислот. Состояние проблемы. Возможности и ограничения метода
Специальные требования к приборам и экспериментальные условия ГХ-анализа производных аминокислот и пептидов
Количественная оценка газовых хроматограмм

Несмотря на то что некоторые вопросы количественного определения уже затрагивались, здесь будет рассмотрен ряд других аспектов этой проблемы в связи с тем, что цель аминокислотного анализа всегда состоит в определении молярного аминокислотного состава пептида. Если не учитывать определенных условий и ограничений, в ГХ особенно велика вероятность получения неверных количественных результатов.

При количественной оценке газовых хроматограмм должны соблюдаться следующие условия, суммированные ниже. Образец следует испарять полностью и все компоненты пропускать через дозатор, трубки, колонку и детектор всегда одним и тем же способом, иначе нужно прибегать к анализу с помощью так называемых внутренних стандартов. В первом случае все компоненты определяют в виде пиков, поддающихся количественной оценке, а во втором каждый пик идентифицируют и рассчитывают отдельно.

Перед фракционированием проводят полную химическую обработку образца, а при хранении следят за тем, чтобы он не подвергался воздействию света, воды или воздуха (во избежание потерь при испарении или разложении).

Дозатор должен быть узким, чистым и достаточно нагретым. Минимальное количество образца вносят в специально подобранную колонку или капилляр и обеспечивают строго постоянный поток газа. Следует знать также, какие вещества разделяли в предыдущих экспериментах на данной колонке.

Хорошо известно, что оценка газовых хроматограмм производится путем измерения площадей индивидуальных пиков. Действительно, точно измеренная площадь пика дает величину, из которой может быть рассчитан конечный результат анализа. Однако с достаточной быстротой и точностью площадь пика можно измерить только с помощью электронных интеграторов. Применявшийся иногда способ планиметрического измерения площади вручную оказался на практике непригодным из-за слишком больших ошибок. Согласно другому методу, делают копию хроматограммы и после соответствующей обработки вырезают и взвешивают пики. Если отсутствует электронный интегратор с автоматической коррекцией нуля, перед тем как вырезать пики, необходимо провести базовую линию. После ее проведения полностью разрешенные пики отделяют друг от друга разделяющими линиями, а затем измеряют их площади.

Как показала практика, хорошие результаты можно получить, применяя следующие приближенные методы расчета:

где A — площадь пика; h — высота пика; w0,5 — ширина пика на уровне половины высоты; k — коэффициент; t — полное время удерживания; w₁₅ — ширина пика на уровне 15% высоты и w₈₅ — ширина пика на уровне 85% высоты.

Последний, третий метод особенно удобен для измерения пиков, которые имеют заметные “хвосты” (фиг. 70).

Когда площади пиков измерены, их нужно умножить на индивидуальные поправочные коэффициенты, специфичные для каждого вещества; в противном случае ошибка количественного анализа может значительно превышать 15%. Поправочный коэффициент зависит не только от природы исследуемого вещества, но и от параметров прибора, в первую очередь от детектора. Поправочные коэффициенты, опубликованные в литературе, довольно неточные, к тому же они могут зависеть от количества определяемого вещества. Для пламенно-ионизационного детектора можно рассчитать приближенные поправочные коэффициенты [1, 48].

Поскольку при аминокислотном анализе желательно иметь значения количеств компонентов в молях, а данные ГХ-анализа дают весовые проценты, необходим соответствующий пересчет. Воспроизводимость данных количественной ГХ составляет в лучшем случае ±1%; при тщательно подобранных условиях работы прибора воспроизводимость может быть улучшена до ±0,2%. Общая точность аналитических данных часто составляет ±10%, так как сюда входят ошибки, обусловленные предварительными препаративными стадиями работы. Для повышения ценности аналитических данных при вычислении простых погрешностей рекомендуется использовать методы математической статистики [49].

Ниже мы рассмотрим предварительную химическую обработку образцов для ГХ, а также критически разберем доводы в пользу или против различных методов.