Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Газохроматографический анализ производных аминокислот. Состояние проблемы. Возможности и ограничения метода
Газовая хроматография пептидов

Разделение и идентификация смеси коротких пептидов, которые могут получаться при частичном кислотном или щелочном гидролизе, а также при неспецифическом ферментативном расщеплении полипептидов и подобных больших молекул, все еще представляют собой довольно трудные задачи, требующие для своего решения сложного оборудования и больших затрат времени. ГХ таких смесей может значительно упростить процедуру, хотя проблема идентификации остается нерешенной. В сущности преимущество ГХ состоит в том, что разделенные соединения можно регистрировать при низких концентрациях, выделять свободными от различных примесей (буферы и др.), а затем подвергать дальнейшим исследованиям.

При разделении пептидов с помощью ГХ возникает ряд проблем, связанных с обилием возможных соединений. Даже разделение природных аминокислот, число которых невелико — довольно трудная задача. Комбинация 18 аминокислот в дипептиды дает 18²=324 различных соединения; комбинация в трипептиды приводит уже к 5832 (18³) разным компонентам. С ростом длины цепи экспоненциально возрастает число соединений.

Полярность этих веществ также возрастает при удлинении цепи. Соответственно температура при ГХ пептидов должна быть выше, и это сильно ограничивает выбор жидких фаз. Даже если предположить, что с ростом длины цепи число выявляемых компонентов существенно уменьшается, оно все же остается настолько большим, что даже эффективности ГХ и родственных ей методов оказывается недостаточно: исследователю приходится мириться с неудовлетворительным разделением и наложением пиков пептидов. Подобные явления будут более заметны для сходных по структуре веществ и соединений, имеющих большое число возможных изомеров. Это означает, что как раз для наиболее длинных фрагментов, которые, естественно, дают большую информацию об исходной последовательности, разделение будет хуже.

В случае применения подобной методики для анализа последовательности аминокислот необходима идентификация разделенных соединений, однако возможности ГХ в. данном случае довольно ограничены. Кроме того, что необходимы колонки различной избирательности, нужно знать и относительные удерживаемые объемы исследуемых соединений. Идентификация непосредственно зависит также от доступности подходящего стандарта. Если дипептиды можно синтезировать химически, то для более длинных пептидов это очень трудная задача. Применение ГХ только в целях разделения оправдано лишь тогда, когда выделенные пептидные производные можно уверенно идентифицировать и определить их последовательность с помощью других методов.

Отсюда вытекает несколько следствий. Необходимо, чтобы после разделения компоненты были выделены или каким-то образом стали доступны для последующей идентификации. Поэтому при детектировании на газовом хроматографе вещество не должно разрушаться: для этого либо используют подходящие, обычно менее чувствительные детекторы, либо разделяют смесь газа-носителя с образцом после выхода с колонки так, что только часть смеси анализируется в высокочувствительном детекторе. Технически эти требования вполне выполнимы.

Малые количества вещества, которые могут быть получены в результате аналитической ГХ, идентифицировать очень трудно. Вместе с тем использование больших количеств вещества при внесении проб не только лишило бы метод одного из главнейших его достоинств, но могло бы неблагоприятно повлиять на разделяющую способность колонки, поэтому в свете рассмотренных выше проблем разделения этого следует всячески избегать. Следовательно, обычные методы деградации, применяемые для анализа последовательности аминокислот, в данном случае не пригодны.

Как показано многочисленными исследованиями, убедительную идентификацию производных пептидов можно провести с помощью масс-спектрометрии [34, 85, 123]. Комбинация этих двух методов может значительно облегчить анализ последовательности пептидов — к тому же для обоих, методов требуются очень малые количества вещества. Газовая хроматография пептидов изучалась только в двух лабораториях, в которых были предложены различные методики получения их производных. Для последующей идентификации крайне важно, чтобы структуру исходных соединений можно было узнавать по их производным. Хотя детальное рассмотрение масс-спектрометрии выходит за рамки рассматриваемого ниже процесса ГХ пептидов, многие операции, которые будут описаны, должны рассматриваться с учетом возможного использования масс-спектрометрического метода. Соединение капиллярной или набивной колонки непосредственно с масс-спектрометром дает возможность измерять полный масс-спектр каждого пика и, таким образом, с помощью этого способа получать необходимую информацию.

Наряду с простым отбором фракций в капилляры на выходе газового хроматографа и переносом их в масс-спектрометр существуют различные способы соединения этих двух приборов [13, 20, 33, 75, 97].