Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Анализ белков с помощью низковольтного электрофореза
Низковольтный электрофорез на бумаге
Определение содержания белка

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ

Принцип метода. Экстинкция белков, содержащих фенилаланин, тирозин и триптофан, при 280 нм прямо пропорциональна их концентрации в растворе. Следует помнить, что коэффициенты экстинкции у разных белков различны.

Методика. Бесцветный, совершенно прозрачный раствор белка помещают в соответствующую кювету спектрофотометра и определяют величину экстинкции при длине волны 280 нм. Концентрацию белка рассчитывают, исходя из известного коэффициента экстинкции.

Примечания. 1. Достоинствами спектрсфотометрического определения белка являются простота, скорость и легкость выполнения. При использовании соответствующей аппаратуры (например, прибора “Увикорд” фирмы LKB, Швеция) этот метод позволяет проводить непрерывное определение концентрации белка в растворе.

2. Ограничение этого метода обусловлено тем, что его нельзя с равной эффективностью применять для определения разных белков, так как содержание ароматических аминокислот в них широко варьирует. Кроме того, ряд веществ небелкового происхождения может мешать определению белка (например, нуклеиновые кислоты, окрашенные простетические группы и т. д.).

3. Коэффициент экстинкции разных белков при длине волны 280 нм варьирует от 0,5 до 1,0 см³ ∙ мг^-1.

4. Спектрофотометрическим методом можно определить белок в концентрации не ниже 10—20 мкг/мл.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА С ПОМОЩЬЮ ФЕНОЛЬНОГО РЕАКТИВА ФОЛИНА—ЧИОКАЛЬТЕУ [8]

Принцип метода. Фенольный реактив Фолина—Чиокальтеу дает синее окрашивание с щелочными растворами белков. Интенсивность окрашивания в основном зависит от содержания в исследуемом белке тирозина и триптофана.

Чувствительность метода. С помощью макрометода можно определить 100—500, а микрометода — 5—35 мкг белкового азота.

МАКРОМЕТОД

Реактивы. 1. Фенольный реактив Фолина—Чиокальтеу, приготовление. В колбе на 2 л в 700 мл дистиллированной воды растворяют 100,0 г Na₂WO₄∙Н₂О и 25,0 г Na₂MoО₄∙H₂О, затем добавляют 50 мл 85%-ного раствора Н₃РО₄ и 100 мл концентрированной НСl. Смесь в течение 10 ч кипятят с обратным холодильником, затем добавляют 150,0 г Li₂SO₄, 50 мл дистиллированной воды и несколько капель брома; еще раз кипятят 15 мин для удаления избытка брома без обратного холодильника. После охлаждения объем реактива доводят до 1000 мл дистиллированной водой и фильтруют в бутыль из темного стекла, так как реактив следует хранить в темноте и оберегать от бактериального прорастания и попадания восстанавливающих веществ.

2. 20%-ный раствор Na₂CO₃.

Методика. 9 мл исследуемого раствора вносят пипеткой в центрифужную пробирку или коническую колбу на 50 мл и медленно при постоянном помешивании добавляют к нему 5 мл 20%-ного раствора Na₂CO₃. После этого, осторожно перемешивая, по каплям вливают 1 мл реактива Фолина—Чиокальтеу. Пробу на 5 мин погружают в водяную баню при 37° С, затем на 30 мин оставляют при комнатной температуре и определяют оптическую плотность при 750 нм.

Контрольная проба: к 9 мл дистиллированной воды добавляют 5 мл 20%-ного раствора Na₂CO₃и 1 мл реактива Фолина.

МИКРОМЕТОД

Реактивы. 1. Раствор А: 2%-ный раствор Na₂CO₃ в 0,1 н. NaOH.

2. Раствор В: 0,5%-ный раствор CuSO_4∙5H₂O b 1%-ном растворе виннокислого натрия.

3. Раствор С: к 60 мл раствора А добавляют 1 мл раствора В; готовят непосредственно перед использованием.

4. Раствор D: реактив Фолина—Чиокальтеу (см. выше). Непосредственно перед применением реактив Фолина—Чиокальтеу титруют раствором NaOH известной нормальности в присутствии фенолфталеина и по данным титрования разбавляют до концентрации 1 н. (обычно примерно вдвое).

Методика. 0,2 мл исследуемого раствора, который может содержать от 5 до 100 мкг белка, смешивают в пробирке с 1 мл раствора С, оставляют на 10 мин и очень быстро в полученную смесь вносят 0,1 мл раствора D, 1—2 с встряхивают, оставляют на 30 мин и спектрофотометрируют при 750 нм. Каждое определение необходимо проводить с параллельными пробами.

Примечания. 1. Интенсивность цветной реакции с разными белками может быть различной, поэтому при постановке как макро-, так и микрометода для каждого исследуемого белка рекомендуется построить калибровочную кривую.

2. Цветная реакция зависит не только от содержания тирозина и триптофана в данном белке, но и от присутствия SH- и других восстанавливающих групп, а также от времени, в течение которого белок содержался в щелочной среде до прибавления реактива Фолина—Чиокальтеу.

3. Определение белка по Фолину—Чиокальтеу проводится довольно быстро и не требует предварительного разрушения исследуемого материала, поэтому оно, несомненно, удобнее определения белка по Кьельдалю. Однако если требуется выразить результаты в единицах белкового азота, то следует построить калибровочную кривую на основе количественного определения белкового азота по Кьельдалю.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА С ПОМОЩЬЮ БИУРЕТОВОЙ РЕАКЦИИ [4]

Принцип метода. В щелочных растворах белков 4 атома азота, участвующие в пептидных связях, могут вступить в комплекс с одним атомом меди; эта реакция дает сине-фиолетовое окрашивание.

Чувствительность метода. С помощью биуретовой реакции можно количественно определить от 20 до 400 мкг белкового азота.

Реактивы. Биуретовый реактив в 1 л раствора содержит виннокислый калий-натрий 9,0 г; CuSO₄∙ 5Н₂O 3,0 г; KI 5,0 г; 0,2 н. NaOH (свободный от карбонатов).

Виннокислый калий-натрий растворяют в 400 мл 0,2 н. NaOH и прибавляют сульфат меди. Когда компоненты растворятся, добавляют йодистый калий и 0,2 н. NaOH, а затем доводят объем раствора до 1000 мл.

Методика. 1 мл исследуемого раствора белка смешивают с 1,5 мл биуретового реактива, оставляют на 30 мин при 37°С и определяют оптическую плотность при 555 нм.

Контрольная проба. 1 мл дистиллированной воды смешивают с 1,5 мл биуретового реактива. Каждое определение проводится с параллельными пробами.

Примечание. При использовании биуретового реактива в количественной реакции преципитации (см. стр. 125) удобно ставить реакцию в центрифужных пробирках на 8 мл, имеющих отметку 2,5 мл. После отмывки преципитат растворяют в 1,5 мл биуретового реактива и доводят объем раствора до метки (2,5 мл) дистиллированной водой. После инкубации определяют оптическую плотность.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ С ПОМОЩЬЮ НИНГИДРИНОВОЙ РЕАКЦИИ [13]

Принцип метода. Нингидрин дает цветную реакцию с концевыми a-NH₂-гpyппaми белков, а также с ε-NH₂-гpyппaми остатков лизина.

Чувствительность метода. Метод применим в том случае, когда исследуемый раствор содержит 1—20 мкг белкового азота.

Реактивы. 1. Приготовление 0,2 М цитратного буферного раствора pH 5,0: 2,101 г одноводного кристаллогидрата лимонной кислоты С₆Н₈О₇ ∙ Н₂О растворяют в 20 мл 1 н. NaOH и добавляют 50 мл дистиллированной воды. После двукратного разведения дистиллированной водой pH буферного раствора должен быть 5,0±0,1. Раствор можно хранить в холодильнике, добавив несколько кристалликов тимола.

2. Метилцеллозольв (монометиловый эфир этиленгликоля).

3. Пропанол-водная смесь (смесь равных объемов н-пропанола и дистиллированной воды).

4. Нингидриновый реактив. Приготовление нингидринового реактива: 40 мг SnCl₂ ∙ 2Н₂О растворяют в 25 мл цитратного буферного раствора и добавляют 4,0 мг нингидрина, предварительно растворенного в 12,5 мт метилцеллозольва. Реактив готовят непосредственно перед опытом.

Методика. 0,1 мл исследуемого раствора белка вносят пипеткой в пробирку на 5 мл со шлифом и прибавляют 0,5 мл нингидринового реактива; закрывают стеклянной пробкой, тщательно перемешивают и 20 мин кипятят на водяной бане. Затем прибавляют 2 мл пропанол-водной смеси, раствор перемешивают, центрифугируют и определяют оптическую плотность надосадочной жидкости при 570 нм.

В контрольной пробе все операции проводят с 0,1 мл дистиллированной воды.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА С ПОМОЩЬЮ АМИДОВОГО ЧЕРНОГО [9, 10]

Принцип метода. Амидовый черный связывается белками пропорционально количеству белка.

Чувствительность метода. Метод применим для исследования образцов, содержащих не менее 0,01 мг белка. С его помощью довольно удобно определять концентрацию белков в растворах с малым содержанием белка, например в спинномозговой жидкости, в водянистой влаге глаза и т. д.

Реактивы. 1. Раствор красителя: насыщенный раствор амидового черного 10 В в охлажденной смеси ледяная уксусная кислота — метанол (1 : 9) (см. стр. 49).

2. Отмывающий раствор: смесь ледяная уксусная кислота — метанол (1 : 9).

3. Растворитель: 0,1 н. NaOH.

Методика. К 0,2 мл исследуемого раствора белка (в центрифужной пробирке) добавляют 1,0 мл дистиллированной воды, затем пипеткой в пробирку вносят сначала 1, а затем после тщательного перемешивания еще 4 мл красителя. Встряхивают несколько раз и оставляют смесь на 20 мин при комнатной температуре; центрифугируют при 2000 об/мин 10 мин, надосадочную жидкость осторожно сливают или отсасывают пипеткой. Осадок промывают отмывающим раствором до тех пор, пока надосадочная жидкость после очередного центрифугирования не останется бесцветной. Отмытый осадок растворяют в 5 мл растворителя и измеряют оптическую плотность в 1-сантиметровой кювете со светофильтром S-61 при 595 нм против контроля. Величина экстинкции, умноженная на 105, дает величину концентрации белка в мг%.