Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Анализ белков с помощью низковольтного электрофореза
Электрофорез в агаровом геле

Принцип метода: см. электрофорез на бумаге. В качестве поддерживающей среды используется агаровый гель.

Область применения: см. электрофорез на бумаге.

ПРИБОРЫ

1. Истопник тока: см. стр. 46.

2. Прибор для электрофореза: см. стр. 46.

МЕТОДИКА

1. Приготовление буферного раствора: см. стр. 47.

2. Очистка агара: см. стр. 127.

3. Приготовление агарового слоя. Стеклянные пластинки тщательно отмывают, высушивают и размещают на строго горизонтальной поверхности (см. стр. 138).

К двум краям стеклянной пластинки прикладывают две смоченные буферным раствором полоски фильтровальной бумаги шириной 40 мм так, чтобы край бумаги шириной 10 мм соприкасался со стеклом, а отрезок бумажной полоски шириной 30 мм выходил за пределы пластинки.

После этого поверхность стеклянной пластинки заливают сверху очень тонким слоем расплавленного агара (1,5%-ный агар в буферном растворе). Этот слой агара должен фиксировать бумажные полоски и предотвратить прилипание к стеклу основного слоя агара, который наносят во вторую очередь.

Как только первый тонкий слой агара затвердеет, на стекло наносят основной поддерживающий слой 1,5%-ного расплавленного агара в вероналовом буферном растворе pH 8,6. Этот слой должен иметь толщину 3—4 мм и покрывать всю поверхность стекла и полоски фильтровальной бумаги. Для этого требуется примерно 250—300 мл расплавленного агара.

После затвердения агара его подравнивают по контуру пластинки и полосок фильтровальной бумаги с помощью лезвия бритвы или острого скальпеля. Для дальнейшей обработки пластинку помещают на специальную подставку, например деревянный брусок или коробочку, имеющую ширину и высоту приблизительно 10 см. После того как пластинку приподнимут, прикрепленные к ней с обеих сторон и покрытые сверху агаром бумажные полоски будут свисать под прямым углом. При закреплении пластинки в электрофоретической камере эти полоски погружаются в буферный раствор. Чтобы обеспечить равную электропроводность во всех участках агарового слоя, необходимо восстановить его целостность в местах перегиба бумажных полосок на краях пластинки. Это делают в последнюю очередь, осторожно заливая пипеткой расплавленный агар в те места, где произошло повреждение слоя.

Прежде чем закрепить пластинку с агаром в электрофоретической камере, в агаровом слое вырезают лунки для внесения исследуемого материала. Обычно эти лунки имеют размер от 3 до 15 мм и располагаются на расстоянии 12—15 мм одна от другой. Их вырезают лезвием, скальпелем или специальным инструментом из стекла или металла, предназначенным для этой цели. Кусочки вырезанного агара удаляют, подцепив их крючком снизу или отсасывая шприцом с большой канюлей.

4. Внесение исследуемого материала. Приготовленную пластинку с агаром закрепляют в электрофоретической камере. Свисающие с ее концов покрытые в верхней части агаром полоски фильтровальной бумаги погружают в буферный раствор. 0,2 мл исследуемой сыворотки разбавляют 0,3 мл дистиллированной воды, подогревают до 40° С и смешивают с 0,5 мл 3%-ного расплавленного агара (приготовленного на дистиллированной воде), охлажденного до 40° С. Нагретой пипеткой эту смесь заливают в лунку, сделанную в агаре. После внесения образцов оставшееся в лунках пространство заполняют 1,5%-ным агаром, приготовленным на буферном растворе. Необходимо следить за тем, чтобы расплавленный агар был полностью свободен от пузырьков воздуха.

5. Электрофорез. При градиенте напряжения 6 В/см фракционирование сыворотки крови продолжается 4—5 ч. Во время электрофореза температура агара не поднимается выше 30° С, поэтому специальных приспособлений для охлаждения не требуется.

6. Фиксация белков. Как только электрофорез закончился, полоски фильтровальной бумаги, свисающие с концов пластинки, обрезают ножницами, а пластинку с агаром погружают на 1 ч в 2%-ный раствор уксусной кислоты. В результате этой процедуры в агаре можно отчетливо наблюдать зафиксированные белковые фракции.

7. Высушивание агарового слоя. После фиксации слой агара сверху накрывают фильтровальной бумагой, смоченной в дистиллированной воде. Бумагу следует разгладить на поверхности агара, чтобы между ней и агаром не было пузырьков воздуха. Затем агаровый слой оставляют на ночь при 37° С для подсушивания. После высушивания бумагу удаляют и агаровый слой окрашивают одним из предлагаемых методов.

МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ АГАРОВЫХ ЭЛЕКТРОФОРЕГРАММ

ОКРАШИВАНИЕ БЕЛКОВ АМИДОВЫМ ЧЕРНЫМ 10В

Окрашивающий раствор: 1,0 г амидового черного растворяют в 900 мл ацетатного буферного раствора. Ацетатный буферный раствор готовят смешиванием 500 мл 1 М уксусной кислоты (60 г/л), 500 мл 0,1 М CH₃COONa ∙ 3Н₂О (13,6 г/л) и 100 мл глицерина.

Отмывающий раствор: смешивают 830 мл дистиллированной воды, 20 мл уксусной кислоты и 150 мл глицерина. После окрашивания в течение 5 ч агаровые пластинки отмывают, меняя каждые 20 мин отмывающий раствор, пока не содержащие белка участки агара не освободятся от красителя.

Во время окрашивания слой агара отклеивается от стекла. После того как отделившиеся агаровые пластинки окрасятся, их помещают на стекло и высушивают при комнатной температуре.

ОКРАШИВАНИЕ ЛИПОПРОТЕИДОВ СУДАНОМ ЧЕРНЫМ

Окрашивающий раствор: 1,2 г Судана черного растворяют в смеси, содержащей 400 мл абсолютного спирта, 380 мл дистиллированной воды и 20 мл 25%-ного раствора NaOH. Раствор доводят до кипения и охлаждают.

Отмывающий раствор: 50%-ньш этанол. После окрашивания в течение 2 ч агаровые пластинки отмывают, дважды погружая на 15 мин в отмывающий раствор. Если окрашенный препарат поместить на 5 ч в 15%-ный водный раствор глицерина, происходит отделение агаровой пластинки от стекла.

Количественное определение белков при электрофорезе в агаре. Процентное содержание полученных фракций можно определить фотоэлектрическим методом. Отделенная от стекла и высушенная агаровая пластинка достаточно прозрачна, поэтому ее без дополнительной обработки помещают между стеклянными пластинками денситометра и проводят измерение оптической плотности, как описано на стр. 63.

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Миграция белков в слое агарового геля подобна их движению при свободном электрофорезе. Однако в агаровом геле значительно сильнее, чем при электрофорезе на бумаге, выражен электроосмос, который усиливает поток буферного раствора в сторону катода. Чтобы устранить возможные артефакты, следует размещать лунки для внесения исследуемого образца точно в центре агаровой пластинки.

2. В электрофоретических камерах типа Грассмана—Ханнига можно использовать стеклянные пластинки размером 16 х 4 см. Приготовление агарового слоя на этих пластинках производится так же, как описано выше.

3. Вместо того чтобы вносить белковый раствор (например, сыворотку крови) в заранее вырезанную лунку, можно нанести его на отрезок фильтровальной бумаги 10 х 3 мм и приложить бумагу к поверхности агара в соответствующем месте, после чего белковый раствор диффундирует в гель. Преимущество этого способа заключается в том, что отпадает необходимость вырезать нарушающие целостность электрофореграммы лунки. Но, с другой стороны, при этом способе внесения образца нельзя точно определить количество белка, продиффундировавшего в агар.

4. Во время электрофореза можно непосредственно наблюдать за миграцией белков сыворотки, если окрасить их конго красным или бромфеноловым синим. Эти красители движутся вместе с фракцией альбумина.

5. Кроме описанного фиксатора, при окрашивании липопротеидов можно применять также фиксирующий раствор следующего состава [29]: смесь 500 мл этанола, 20 мл 10%-ного раствора СаСl₂ и 20 мл уксусной кислоты, объем которой доводят до 1000 мл дистиллированной водой. Агаровые пластинки помещают в этот фиксатор на 6 ч.