Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Методы иммунохимического анализа
Анализ белков методами диффузии в геле
Иммунодиффузионный анализ белков на ацетат-целлюлозных мембранах

Примененные Коном (стр. 71) для электрофореза ацетат-целлюлозные мембраны могут быть также - успешно использованы в опытах по иммунодиффузии. Ацетат-целлюлозные мембраны лишены ряда недостатков, присущих агаровому гелю.

ДВУМЕРНАЯ ДВОЙНАЯ ДИФФУЗИЯ

Принцип метода. Раствор белкового антигена и специфическая иммунная сыворотка, диффундируя навстречу друг другу на ацетат-целлюлозной мембране, в месте встречи образуют полосы преципитации.

Область применения: см. стр. 131.

МЕТОДИКА

Из листа ацетат-целлюлозной мембраны вырезают круг нужного диаметра и карандашом или недиффундирующей краской отмечают на нем места нанесения антигена и иммунной сыворотки. Затем мембрану смачивают буферным раствором, осторожно промокают фильтровальной бумагой и в горизонтальном положении помещают во влажную камеру (например, на дно чашки Петри, крышка которой изнутри выстлана влажной фильтровальной бумагой).

В отмеченные места мембраны капиллярной пипеткой наносят 1—5 мкл раствора антигена и иммунной сыворотки в виде небольших пятен или коротких линий. Обычно иммунную сыворотку наносят на расстоянии 10 мм от места нанесения антигена, но в зависимости от цели эксперимента это расстояние можно варьировать. Мембрану держат во влажной камере до тех пор, пока нанесенный материал полностью не впитается, и затем погружают ее в вазелиновое масло.

В течение двух дней в мембране, оставленной под вазелиновым маслом, при комнатной температуре образуются полосы преципитации.

По окончании инкубации мембрану извлекают из масла и через некоторое время, когда стечет его избыток, быстро проводят через эфир. После этого мембрану на 1—5 ч помещают в физиологический раствор хлористого натрия для удаления растворимых белков, не участвовавших в реакции преципитации; затем ее извлекают, промокают фильтровальной бумагой и окрашивают для выявления полос преципитации, как описано на стр. 73.

ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ

Принцип метода. Исследуемый антиген подвергают электрофорезу на ацетат-целлюлозной мембране. После этого на. мембрану наносят специфическую иммунную сыворотку, и в результате ее диффузии образуются полосы преципитации, выявляемые при окрашивании.

Область применения, (см. стр. 137).

Приборы (см. стр. 71).

МЕТОДИКА

Электрофорез на ацетат-целлюлозных мембранах описан на стр. 71. По окончании электрофореза на закрепленную в электрофоретической камере мембрану капиллярной пипеткой наносят иммунную сыворотку. Наносить следует по возможности одним движением на расстоянии 0,1—1,0 см от места нанесения исследуемого образца параллельно направлению его разделения при электрофорезе. После того как нанесенная иммунная сыворотка впитается, мембрану извлекают из электрофоретической камеры и погружают в вазелиновое масло. Остальные стадии методики те же, что и в предыдущем методе исследования (стр. 161).

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Интерпретация результатов иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза на ацетат-целлюлозной мембране не отличается от описанной соответственно на стр. 131 и 142.

2. Вазелиновое масло не денатурирует белки, но эфир обладает этим свойством, поэтому, удаляя масло, не следует держать в эфире мембрану дольше 10—20 с. В заключение рекомендуется промыть мембрану проточной водой.

3. Необходимо следить за тем, чтобы перед погружением в вазелиновое масло мембрана была равномерно смочена буферным раствором. Если часть мембраны подсохла, ее следует вновь поместить во влажную камеру.

4. Во избежание загрязнения следует брать мембрану только пинцетом. Необходимо постоянно следить за тем, чтобы используемые растворы и материалы не были проросшими, так как бактериальный рост мешает проведению реакции.

5. Использование мембраны вместо агарового геля дает существенные преимущества: для анализа требуется еще меньше исследуемого материала, мембраны проще хранить и, кроме того, их легче окрасить.

Цитированная литература

1. Backhausz R., Serologie, in: Rajka Ö, Allergie und allergische Erkrankungen, Akademiai Kiadó, Budapest, 1950.

2. Backhausz R., Immunodiffusion und Immunoelektrophorese, Akademiai Kiadó, Budapest, 1967.

3. Batory G., Ann. Immunol., Hung., 5, 127(1962).

4. Bussard D., Biochim. Biophys. Acta, 34, 258 (1959).

5. Fahey J. L., McKelvey E. M., J. Immunol., 94, 84 (1965).

6. Feinberg J. G., Int. Arch. Allergy, 11, 129 (1957).

7. Freund J., Annu. Rev. Microbiol., 1, 291 (1947).

8. Grabar P., Williams С. A., Biochim. Biophys. Acta, 10, 193 (1953).

9. Grabar P., Williams С. A., Biochim. Biophys. Acta. 17, 67 (1955).

10. Hanson L. A., Johansson B. G., Rymo L., Clin. Chim. Ada, 14, 391 (1966).

11. Hartmann F., Z. Rheumaforsch, 16, 150 (1957).

12. Heidelberger M. F. E., Kendall C. M., Soo Hoo C. M., J. Exp. Med., 58, 137 (1933).

13. Kohn J., Nature, 183, 1512 (1959).

14. Laureil L. B., Anal. Biochem., 15, 45 (1966).

15. Oakley C. L., Fulthorpe A. J., J. Path. Bact., 65, 49 (1953).

16. Ossermann E. P., J. Immunol., 84, 93 (I960).

17. Ouchterlony О., Acta Path. Microbiol. Scand., 32 , 231(1953).

18. Oudin J., Ann. Inst. Pasteur, 75, 30 (1948).

19. Oudin J., Ann. Inst. Pasteur, 75, 109 (1948).

20. Preer J. R., Jr., J. Immunol., 77, 52 (1956).

21. Scheidegger J. J., Int. Arch. Allergy, 7, 103 (1955).

22. Uriel J. P., Grabar P., Wunderly Ch., Clin. Chim. Acta, 2, 35 (1957).

Рекомендуемая литература

Boyd W. C., Fundamentals of Immunology, Interscience Publ. Ltd., London, 1956. (У. Бойд, Основы иммунологии, изд-во “Мир”, М., 1969.)

Crawle A. J., Immunodiffusion, Academic Press, New York, London, 1961. Determann H., Gel-chromatography, Springer Verlag, Berlin, 1968. (Г. Детерман, Гель-хроматография, изд-во “Мир”, М., 1970.)

Kabat Е. А., Einführung in die Immunochemie, Springer Verlag, 1971.

Kabat Е. A., Mayer М. М., Experimental Immimochemistry, Thomas Publ., Springfield, 1961. (E. Кэбот, M. Мейер, Экспериментальная иммунохимия, Медицина, М., 1968.)

Keil В., Sormova Z., Laboratoriumstechnik für Biochemiker, Akademische Verlagsgesellschaft, Leipzig, 1955.

Ouchterlony Ö., Diffusion-in-gel methods for immunological analysis, Progr. Allergy, 6, 30 (1952).

Weir D. M., Handbook of Experimental Immunology, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1973.

Williams C. A., Chase M. W., Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol. Ill, Academic Press, New York, London, 1971.