Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Некоторые методологические вопросы аналитического исследования белков
Изучение нативных белков
Изучение нативных белков иммунохимическими етодами

Изучение явления специфической преципитации, возникающей при взаимодействии антител с антигенами in vitro, в конце прошлого столетия привело к возникновению новой научной дисциплины — иммунохимии, которая включает изучение химических аспектов иммунитета, в первую очередь химии антигенов, антител и их взаимодействия. Высокая чувствительность и специфичность иммунологических реакций позволили применить их с большой пользой для исследования белков. Иммунохимия не только увеличила методические возможности изучения белков, но и создала новое направление их анализа.

ТЕРМИНОЛОГИЯ

Если парентерально (т. е. минуя пищеварительный тракт) ввести в организм животного чужеродные вещества, например белки иной видовой принадлежности или бактерии, то вскоре после одной или нескольких таких инъекций в сыворотке этого животного появятся особые вещества, способные реагировать с введенными белками. Эти вещества получили название антител, тогда как факторы, вызывающие их появление, были названы антигенами. Антигенность белковой молекулы определяется теми участками образующих ее полипептидных цепей, которые не встречаются в структуре молекул реципиента (т. е. иммунизируемого животного). Эти участки называют антигенными детерминантами.

Если раствор антигена (например, раствор белка) в адекватных пропорциях смешать с сывороткой, содержащей специфические антитела (иммунной сывороткой), то я результате реакции образуется преципитат, образованный молекулами антигена и антител. Наибольшее разведение иммунной сыворотки, при котором еще происходит реакция преципитации с антигеном, присутствующим в постоянной концентрации, называют титром данной сыворотки. Титр отражает ее активность; например, сыворотка с титром 1:25 000 считается в пять раз активнее сыворотки, имеющей титр 1 : 5000.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О РЕАКЦИЯХ ПРЕЦИПИТАЦИИ

Реакция преципитации происходит в два этапа, во время которых реагирующие молекулы антигена и антител связываются друг с другом без каких-либо заметных изменений своей исходной химической структуры. Связывание антигена с антителами специфично, причем эта реакция частично или полностью обратима.

На первом этапе реакции преципитации происходит связывание молекул антигена с антителами, но видимых преципитатов не образуется. На втором этапе реакции происходит агрегация возникших ранее комплексов антиген — антитело с образованием больших нерастворимых частиц, видимых невооруженным глазом. Первый этап реакции протекает быстрее, более обратим и специфичен, чем второй.

Главной чертой иммунохимических реакций является высокая специфичность, однако необходимо подчеркнуть, что структурное сходство некоторых белков, а также гетерогенность антител, иногда свойственная сывороткам, при определенных условиях становятся причиной так называемых перекрестных реакций. Это означает, что реакция преципитации может в определенной степени зависеть от неспецифических факторов. Однако последнее обстоятельство лишь незначительно ограничивает использование иммунохимических реакций в изучении белков.

В ряде вопросов, например при выяснении родства между белками, при сравнении фракций патологических и нормальных белков и т. д., перекрестные реакции оказывают существенную пользу. Реакции преципитации весьма чувствительны. Например, с помощью антисыворотки соответствующего титра можно обнаружить овальбумин в концентрации 1 мкг/мл. В зависимости от используемого метода определения азота в количественной реакции преципитации удается обнаружить от 75 до 125 мкг антигенного азота.

В некоторых реакциях преципитации количественный анализ образовавшегося преципитата дает абсолютные величины содержания антигена или антител (метод количественной преципитации). Другие реакции позволяют получать лишь относительные величины (определение титра).

Образование преципитата зависит от ряда факторов. Наиболее существенными из них являются mump иммунной сыворотки, соотношение концентраций антигена и антител, а также видовая принадлежность иммунной сыворотки.

Для реакции преципитации необходимо оптимальное соотношение концентраций антигена и антител. В избытке антигена преципитат частично или полностью растворяется; в результате бывает невозможно оценить реакцию или же эта оценка может быть ошибочной. В то время как преципитаты, образованные кроличьими антителами, растворяются только при избытке антигена, преципитаты, образованные антителами лошади, часто могут растворяться в избытке как антигена, так и антител.

Для реакции преципитации оптимальными являются те значения температуры, pH и ионной силы среды, которые существуют в организме. Ход реакции преципитации зависит от ионной силы раствора: с увеличением концентрации соли выше 0,15 М постепенно замедляется образование преципитата. В то же время pH среды в довольно широком диапазоне, от 6,5 до 8,6, не влияет на реакцию преципитации.

Реакция преципитации происходит вскоре после смешивания растворов антигена и иммунной сыворотки. Ее предварительный результат, как правило, можно учитывать через 30—60 мин инкубации полученной смеси при 37° С. Преципитация обычно завершается через 24 ч инкубации в холодильнике. При постановке реакции иммунодиффузии, когда соединение реагентов происходит лишь после их диффундирования в поддерживающей среде (например, в агаре), время образования преципитата, помимо прочих моментов, зависит от скорости диффузии.

Иммунохимические методы, основанные на реакции преципитации, очень удобны для качественного и количественного анализа белков, для определения гомогенности белковых препаратов и наличия в них примесей, а также для идентификации компонентов белковых смесей. Как вспомогательный метод реакция преципитации применяется для изучения структуры белка. Преимущество этого метода по сравнению с другими состоит в том, что он может быть использован тогда, когда нельзя провести количественный химический анализ, например при определении данного компонента в смеси белков. Именно в этих случаях результаты, полученные с помощью иммунохимических реакций, могут быть очень полезны.

МЕТОДЫ ИММУНОДИФФУЗИИ

Наиболее простой способ исследования растворимых антигенов в реакции преципитации заключается в том, что исследуемый раствор смешивают со специфической иммунной сывороткой, а затем наблюдают образование преципитата. Эта реакция применяется главным образом для определения титров. Только в том случае, когда реакция ставится с иммунной сывороткой, специфичной к данному белку, величина титра может служить характеристикой белкового препарата. Действительно широкое применение иммунохимического подхода к анализу белков началось только после того, как появились иммунодиффузионные методы исследования.

В 1905 г. Бекхольд, наслоив козью сыворотку на смешанную с желатиной кроличью антисыворотку к белкам козы, наблюдал в геле образование двух полос преципитации. Иммунологическая природа этого “коллоидно-химического” явления была раскрыта лишь спустя несколько десятилетий. На основе реакции преципитации в геле был разработан ряд новых методов исследования, которые не только позволили охарактеризовать иммунологические свойства белков, но и открыли новые перспективы их углубленного анализа.

В сущности все методы иммунодиффузии основаны на явлении, которое наблюдал Бекхольд: взаимодействии антиген — антитело в геле. Растворимый белковый антиген и иммунная сыворотка диффундируют в геле навстречу друг другу. В месте встречи обоих реагентов возникает полоса преципитации, которую можно легко наблюдать и регистрировать.

Для приготовления полужидкого геля используют ряд веществ. Их наиболее важным свойством должна быть инертность по отношению к исследуемым белкам и иммунной сыворотке. Эти вещества не должны вступать с ними в какие-либо реакции. К таким веществам можно отнести агар, крахмал, желатину, пектин и т. д. В настоящее время наиболее широко применяется агар, который оказался наилучшей средой при повседневной постановке реакций иммунодиффузии. При нагревании агар легко растворяется в воде и растворах солей и образует плотный гель при комнатной температуре. Прозрачность агара позволяет ясно различать возникающие в геле линии преципитации и окрашивать их соответствующими красителями.

Особое значение методов иммунодиффузии в изучении белков состоит в том, что с их помощью можно характеризовать белки на основании свойств, отличных от тех, которые были известны ранее. Электрофорез позволяет фракционировать белки в соответствии с их физико-химическими свойствами, в то время как с помощью классических методов иммунологии можно проводить дальнейшую дифференцировку белковых компонентов по антигенным свойствам.

Поэтому методы иммунодиффузии открывают перед исследователем дополнительные возможности:

1. Они позволяют одновременно анализировать несколько систем антиген—антитело (в смеси белков).

2. Можно сравнивать между собой разные белковые антигены.

3. Одновременно можно изучать и иммунологические и электрофоретические свойства белков.

4. Можно проводить количественное определение белков.

Каждый компонент белковой смеси и соответствующие антитела

иммунной сыворотки в геле диффундируют навстречу друг другу, и каждая пара реагентов при слиянии образует одну линию преципитации. Число появившихся линий преципитации соответствует минимальному числу разных антигенов и соответствующих антител, присутствующих в системе. Методы иммунодиффузии очень чувствительны: они позволяют выявлять до 2—18 мкг белкового азота в 1 мл [3], с их помощью можно проводить изучение растворов с низкой концентрацией белка, которые не годятся для исследования методом электрофореза.

Электрофорез и классические иммунологические реакции также используются для сравнения белковых смесей и отдельных нативных белков. Однако разрешающая способность этих методов ограничена, так как они дают либо физико-химическую, либо иммунохимическую характеристику. В сравнении с ними метод иммунодиффузии более информативен, так как с его помощью в двух или нескольких сравниваемых белковых смесях можно обнаружить не только идентичные компоненты, но и возможные общие антигенные структуры, присутствующие в разных компонентах [11—13].

Особое значение приобрела комбинация иммунодиффузии с электрофорезом, названная методом иммуноэлектрофореза [4]. С его помощью можно одновременно электрофоретически разделить компоненты белковой смеси и получить их иммунологическую характеристику. Простота осуществления, высокая разрешающая способность и, наконец, очень малое количество материала, требуемое для анализа, ставят иммуноэлектрофорез в ряд наиболее ценных методов аналитического изучения белков. Соединение иммуноэлектрофореза с двойной диффузией в геле позволяет выявлять идентичность определенных компонентов двух белковых смесей [10].

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ ИММУНОДИФФУЗИИ

Анализ белков сыворотки осуществляется разнообразными иммунохимическими методами, но здесь мы коснемся лишь двух методов: двойной иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза. Оба метода нашли широкое и многостороннее применение. Их используют для исследования нефракционированной сыворотки и для анализа отдельных белковых фракций. С появлением этих методов удалось открыть и охарактеризовать ряд новых белков сыворотки.

В агаровом геле или на ацетат-целлюлозной мембране белковый антиген и специфические антитела диффундируют навстречу друг другу и образуют в месте контакта линии преципитации, которые можно видеть невооруженным глазом или выявить специальным окрашиванием. При анализе двух белковых смесей, например двух разных сывороток или выделенных нативных белков, с помощью этого метода можно не только узнать число индивидуальных белков, присутствующих в нашей системе, но и получить данные об их иммунохимической идентичности, родственности или различиях. Все эти выводы могут быть сделаны на основании числа и взаимного расположения линий преципитации.

Иммуноэлектрофорез сыграл существенную роль в развитии исследований сывороточных белков. В свое время свободный и зональный электрофорезы позволили проанализировать сравнительно небольшое число индивидуальных белков сыворотки. За исключением 5 классических белков, выявляемых в свободном и зональном электрофорезе, остальные фракции сыворотки не всегда легко поддаются идентификации. Поэтому специальные виды зонального электрофореза с более высокой разрешающей способностью, чем простой электрофорез на бумаге, так и не вошли в повседневную практику клинических лабораторий, сохранив свое значение главным образом для научных исследований. Определение процентного содержания альбумина, a-, ß- и у-глобулинов нередко помогает поставить верный клинический диагноз, но мы должны помнить о том, что фракции белков, гомогенные в зональном электрофорезе, могут включать разные белки, образующие одну фракцию только благодаря сходной электрофоретической подвижности. Об этом свидетельствует также окрашивание липо- и гликопротеидов.

Согласно современным представлениям, плазма циркулирующей крови содержит свыше ста белков, включая гормоны и ферменты. Возможности электрофоретических методов разделения довольно ограничены; с их помощью удается получить лишь около 20 белковых фракций. Однако иммунохимические методы, особенно иммуноэлектрофорез, обладают большими возможностями: они позволяют идентифицировать до 30 фракций белков сыворотки. Значение иммуноэлектрофореза становится еще более наглядным, если принять во внимание, что с помощью микрометода Шейдигера [16] можно анализировать белок в чрезвычайно малых количествах — до 5—10 мкг.

Если по окончании электрофоретического разделения белков в агаровом геле навстречу им диффундирует специфическая иммунная сыворотка, то в местах встречи антигена и антител образуются дугообразные полосы преципитации, каждая из которых соответствует какому-нибудь одному типу сывороточного белка. Полосы преципитации вполне различимы в нативном препарате, но для лучшего выявления их можно окрасить.

Число линий преципитации на электрофореграмме зависит от используемой иммунной сыворотки. Например, хорошо себя зарекомендовавшая кроличья антисыворотка к белкам сыворотки человека фирмы Behringwerke (ФРГ) и аналогичная лошадиная антисыворотка института Human (Венгерская Народная Республика) позволяют идентифицировать примерно 20 белковых фракций сыворотки. Принципиальная возможность приготовления антисыворотки практически к любому белку значительно увеличивает применимость иммуноэлектрофореза. Кроме того, приготовив антисыворотки, специфичные к какому-либо одному-единственному белку (или небольшому числу белков), можно в смеси белков исследовать составляющие ее отдельные компоненты. Иммунные сыворотки, предназначенные для иммунохимического анализа отдельных белков плазмы человека, уже имеются в продаже.

В их числе можно найти антисыворотки к фракциям альбумина, а-1-, а-2-липопротеидов, а-2-макроглобулин-трансферрина, IgG, IgM, IgA и т. д. Очевидно, располагая соответствующими фракциями нативных белков и владея методами получения антисывороток, можно, учитывая запросы экспериментальных исследований, значительно расширить ассортимент имеющихся в продаже препаратов.