Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Гидролиз белков и пептидов
Гидролиз белков и пептидов трипсинов

Принцип метода. Под действием трипсина в белке или пептиде происходит расщепление пептидных связей, образованных остатками лизина и аргинина.

Область применения. Исследование структуры белка.

МЕТОДИКА

1. Выбор подходящего препарата трипсина и его предварительная очистка. Трипсин является наиболее изученным высокоспецифическим протеолитическим ферментом, который способен избирательно расщеплять пептидные связи, образованные остатками лизина и аргинина. Однако имеющиеся в продаже препараты трипсина, приготовленные из экстрактов поджелудочной железы, могут быть загрязнены другими протеазами, поэтому необходимо тщательно подбирать подходящий для конкретных целей препарат трипсина. Лучше всего пользоваться препаратом, классифицированным как “свободный от химотрипсина”. Если в распоряжении исследователя нет такого препарата, то рекомендуется очистить имеющийся трипсин следующим образом: фермент растворяют в 0,01 н. НСl и инкубируют при 37°С в течение 16 ч, затем раствор фильтруют и доводят pH до 7,8.

2. Триптический гидролиз. Гидролизуемый материал растворяют или суспендируют в 0,1 М растворе двууглекислого аммония до конечной концентрации 1% и добавляют к нему ¹/₃₀ часть (по отношению к количеству белка) трипсина. Смесь инкубируют при 37°С 3 ч, затем добавляют еще ¹/₃₀ часть трипсина, вновь инкубируют в течение 1 ч, помещают гидролизат в кипящую водяную баню на 15 мин, фильтруют и лиофилизяруют.

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Гидролиз нерастворимых белков и белковых производных рекомендуется проводить в автотитраторе. Гидролизуемый материал суспендируют в дистиллированной воде, 0,05 н. раствором NaOH доводят pH до 7,5, добавляют трипсин и проводят реакцию при 37°С в атмосфере азота, постоянно перемешивая суспензию и поддерживая pH 7,5 добавлением 0,05 н. раствора NaOH. Гидролиз продолжается в течение 4—5 ч.

2. Нативные белки либо вовсе не атакуются трипсином, либо перевариваются крайне медленно. Не следует забывать также, что при триптическом гидролизе могут образоваться высокомолекулярные нерастворимые структуры, устойчивые к действию фермента, так называемые “кор”-структуры (core).

3. С помощью обратимой, или необратимой блокировки ε-NH₂-групп остатков лизина можно ограничить триптический гидролиз расщеплением только пептидных связей аргинина. Обратимую блокировку можно вызвать, например, с помощью трифторацетилирования.