Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976
Хроматография белков
Хроматография белков на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой
Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе в присутствии мочевины
Помимо хроматографии нативных белков, для решения ряда задач необходимо проводить хроматографическое разделение модифицированных (восстановленных, окисленных, карбоксиметилированных, алкилированных и т. д.) белковых производных. Прежде всего это необходимо при определении аминокислотной последовательности тех белков, которые состоят из нескольких полипептидных цепей различной структуры. В этих случаях, прежде чем приступить к анализу последовательности аминокислот в полипептидных цепях, необходимо разделить последние.
Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе в присутствии высокой концентрации мочевины является одним из лучших методов фракционирования денатурированных или химически модифицированных белков.
Подготовка ДЭАЭ-целлюлозы для хроматографии в Сl- -форме производится так же, как указано выше, но уравновешивание колонки, растворение фракционируемого материала и элюирование осуществляют буферными растворами, содержащими 8 М мочевину. В качестве стартового буферного раствора в данном случае используют буферный раствор трис-НСl pH 8, содержащий 0,05 М Cl-и 8 М мочевины. Чтобы предотвратить агрегацию и ассоциацию молекул фракционируемого материала в присутствии мочевины, к буферному раствору добавляют 0,1% додецилсульфата натрия. В полученном растворе, содержащем оба детергента (мочевину и додецил-сульфат натрия), растворяют фракционируемой материал, который диализуют против того же раствора в течение 24 ч.
Условия связывания фракционируемого материала и подбор градиента для элюирования не отличаются от описанных выше, однако все буферные растворы должны содержать 8 М мочевину.
Удаление мочевины. Почти всю мочевину, содержащуюся в полученных фракциях, удается удалить диализом. После 72 ч диализа в растворе остается не более 1—5% ее первоначального содержания. Если данная фракция растворима в воде, ее освобождают от мочевины гель-фильтрацией. Не растворимый в воде белок можно освободить от мочевины, промывая выпавший при диализе осадок несколько раз дистиллированной водой с помощью центрифугирования.
После этой операции водную суспензию нерастворимого белка лиофилизируют.
ПРИМЕЧАНИЯ
1. Порошкообразную или волокнистую ДЭАЭ-целлюлозу нельзя регенерировать в колонке. По окончании хроматографии ионообменник извлекают из колонки и хранят на холоду. Когда накапливается достаточное количество использованной ДЭАЭ-целлюлозы, ее регенерируют, как описано выше.
2. В связи с опасностью бактериального прорастания не следует оставлять колонку регенерированного, готового к фракционированию ионообменника при комнатной температуре.
3. Подготовка колонки, заполненной сферической ДЭАЭ-целлюлозой (полимер в виде шариков), не отличается от подготовки колонки с гранулярной или волокнистой целлюлозой. Использование сферической ДЭАЭ-целлюлозы имеет ряд весьма существенных преимуществ, несмотря на несколько меньшую разрешающую способность:
1) Скорость протекания жидкости через колонку со сферической ДЭАЭ-целлюлозой постоянна, и во время хроматографии не происходит усадки ионообменника.
2) Заполнение колонки сферической ДЭАЭ-целлюлозой весьма просто; гомогенный столбик ионообменника получить довольно легко.
3) В отличие от других типов ионообменника, которые весьма прочно связывают денатурированные белки, сферическая ДЭАЭ-целлюлоза обладает меньшей абсорбционной способностью и благодаря этому ее можно регенерировать в колонке.
4) Простота заполнения колонки, постоянная скорость протекания жидкости через ионообменник и несложный процесс регенерации делают сферическую ДЭАЭ-целлюлозу пригодной для использования в больших препаративных колонках.
Рекомендуемая литература
Block Н. J., Bolling D., The Amino Acids Composition of Proteins and Foods.
Analytical Methods and Results, Springfield, Thomas Publ., 1951.
Smith I., Chromatographic and Electrophoretic Techniques, Vols 1 and 2, London, Heinemann Publ., 1960.