Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Хроматография белков
Хроматография белков на колонке с катионообменной целлюлозой
КМ-целлюлоза

A. Подготовка КМ-целлюлозы для хроматографии. Перед хроматографией КМ-целлюлозу следует обработать следующим образом:

1) Нужное количество целлюлозы в течение 15 мин перемешивают при комнатной температуре с 5-кратным количеством 0,5 М NaOH. После оседания частиц ионообменника надосадочную жидкость декантируют.

2) Обработанную щелочью КМ-целлюлозу отмывают дистиллированной водой до нейтральной реакции. Гранулярную или волокнистую целлюлозу рекомендуется отмывать с помощью цен трифугирования или фильтрованием на воронке Бюхнера. Сферическая КМ- целлюлозапри отстаивании суспензии оседает очень быстро, поэтому ее можно отмывать декантацией в химическом стакане.

3) Чтобы перевести отмытую до нейтральной реакции КМ-целлюлозу в Н⁺-форму, ее суспендируют в 0,5 н. НСl и перемешивают в течение 15 мин при комнатной температуре. Суспензию оставляют отстаиваться, декантируют надосадочную жидкость и вновь повторяют обработку кислотой. После этого КМ-целлюлозу отмывают дистиллированной водой до нейтральной реакции, как описано в предыдущем разделе.

4) КМ-целлюлоза в Н⁺-форме может храниться в виде водной суспензии при 4°С.

Б. Выбор размеров колонки. Для фракционирования 100 мг белка или полипептида при использовании КМ-целлюлозы, имеющей емкость 0,7—0,8 мэкв/г, требуется колонка 1,5x35 см. Препаративное разделение 1,0 г белка можно проводить на колонке 3,5x45 см.

B. Скорость протекания жидкости через колонку. Скорость протекания определяется свойствами КМ-целлюлозы. В колонке волокнистой или гранулярной целлюлозы размером 1,5x35 см она достигает 60 мл/ч. Чтобы получить хорошее разделение при хроматографии на сферической КМ-целлюлозе, следует несколько уменьшить скорость протекания.

Г. Подбор условий хроматографии. Можно применять как ступенчатое, так и градиентное элюирование. Ступенчатое элюирование удобно только в тех случаях, когда компоненты фракционируемой смеси элюируются при существенно различающихся значениях pH и молярности элюента.

Градиентное элюирование можно осуществлять тремя способами: 1) увеличивать молярность элюента при постоянном pH, 2) менять pH элюента при постоянной молярности, 3) вести элюирование в градиенте как pH, так и молярности элюента.

Выбор оптимальных условий, фракционирования в каждом данном случае делается на основании предварительных опытов хроматографии. Однако, как правило, для фракционирования природных полимеров с катионными свойствами, таких, как полипептиды и белки, удобнее градиентное элюирование с увеличением молярности элюента при постоянном pH.

Хроматографию на КМ-целлюлозе можно начинать как в Н⁺-, так и в NН⁺₄-форме катионообменника. Перевод КМ-целлюлозы в Н⁺-форму описан выше. Перевод катионообменника из Н⁺-формы в NН₄⁺-форму производят следующим образом.

КМ-целлюлозу в Н⁺-форме суспендируют в 5-кратном количестве 0,1 М раствора ацетата аммония pH 4,6 и в течение 30 мин в химическом стакане перемешивают суспензию при комнатной температуре. После оседания частичек целлюлозы надосадочную жидкость декантируют и описанную процедуру повторяют еще три раза. Затем суспензией целлюлозы в том же растворе заполняют колонку и после соответствующего уплотнения отмывают ее 0,01 М буферным раствором до тех пор, пока pH и электропроводность элюата не станут равными этим же показателям элюента.

Д. Хроматография на колонке с КМ-целлюлозой в Н⁺-форме с помощью градиентного элюирования. Колонку 1,5 х 35 см заполняют КМ-целлюлозой в Н⁺-форме и промывают дистиллированной водой,

100 мг фракционируемого материала растворяют в 3—5 мл 0,01 М аммонийацетатного буферного раствора pH 4,6. Удалив слой дистиллированной воды над КМ-целлюлозой в колонке, пипеткой, имеющей загнутый конец, круговыми движениями руки наносят исследуемый раствор на ионообменник. После того как нанесенный раствор войдет в КМ-целлюлозу, его остатки аккуратно смывают тремя порциями буферного раствора по 1 мл.

Через колонку пропускают 1,5 объема (относительно объема ионообменника) 0,01 М аммонийацетатного буферного раствора и начинают градиентное элюирование при постоянном pH 6,7, увеличивая молярность от 0,01 до 0,5 М, а затем при необходимости от 0,5 до 1,0 М.

Для создания градиента в соединенный с колонкой смеситель и в резервуар наливают по 100 мл аммонийацетатного буферного раствора pH 6,7 с молярностями 0,01 и 0,5 М соответственно. Устанавливают скорость протекания 1 мл/мин и после того, как через колонку пройдет 200 мл элюента, если это необходимо, начинают элюирование вторым градиентом молярности, повышая ее от 0,5 до 1,0 М.

Полученные фракции элюата объединяют в соответствии с оптической плотностью при 280 нм (или кривой непрерывной регистрации оптической плотности).

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Основное преимущество используемого аммонийацетатного буферного раствора заключается в его летучести, благодаря которой обессоленные фракции можно получать без диализа лиофилизацией. Кроме того, этот буферный раствор можно использовать в широком интервале pH. Вместе с тем для хроматографии на КМ-целлюлозе можно применять и другие буферные растворы.

2. Для хроматографии используется волокнистая, гранулярная и сферическая КМ-целлюлоза. Волокнистую и гранулярную КМ- целлюлозу из-за высокой абсорбционной активности нельзя регенерировать непосредственно в колонке. По окончании хроматографии приходится извлекать ионообменник из колонки и по мере накопления достаточных количеств подвергать регенерации. Производные целлюлозы подвержены бактериальному заражению, поэтому собираемую для регенерации КМ-целлюлозу следует хранить при 4° С.

3. Абсорбционная способность сферической КМ-целлюлозы весьма невелика, поэтому после 2—4 опытов по фракционированию ее можно регенерировать в колонке.

4. Для препаративного фракционирования рекомендуется использовать сферические ионообменники. Ими легче заполнять колонку, они быстро оседают при отмывании декантацией и обеспечивают постоянную скорость протекания раствора через колонку в отличие от волокнистых и гранулярных носителей, которые вызывают снижение скорости протекания в процессе хроматографии.