Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Гель-фильтрация белков и пептидов
Фракционирование белков сыворотки гель-фильтрацией

Принцип метода. На колонке с сефадексом G-200 фракции белков сыворотки разделяются в соответствии с их молекулярным весом.

Область применения. Фракционирование белковых смесей и очистка выделенных белковых фракций.

МЕТОДИКА

1. Подготовка колонки с сефадексом G-200. Размер колонки 3x80 см. Сефадекс G-200 суспендируют в 0,1 М трис-НСl pH 8,0, содержащем 0,2 М NaCl, и на сутки оставляют для набухания. Мелкие плавающие в надосадочной жидкости частицы удаляют декантацией. На дно колонки кладут фильтр из бумаги или стеклянную вату и наполняют колонку на 1/3 высоты буферным раствором. Сначала в колонку вносят порцию сефадекса G-25, образующего слой высотой 2 см (сефадекс G-25 должен быть предварительно оставлен на сутки в буферном растворе для набухания). Затем начинают заполнять колонку разбавленной суспензией сефадекса G-200 и через несколько минут оседания открывают выходное отверстие. По мере вытеканид буферного раствора продолжают заполнение колонки суспензией сефадекса, следя за тем, чтобы образующиеся при заполнении пузырьки воздуха не задерживались в столбике геля. Когда образуется столбик геля требуемой высоты, через колонку пропускают один объем буферного раствора.

2. Нанесение сыворотки. Открывают выходное отверстие колонки и выпускают буферный раствор до тех пор, пока его уровень в верхней части колонки не достигнет уровня геля. Затем осторожно, чтобы не взмутить верхний слой геля, на сефадекс наслаивают 4— 5 мл сыворотки, предварительно в течение 1 ч диализованной против буферного раствора. После того как нанесенный препарат войдет в гель, его остатки смывают тремя порциями буферного раствора по 4 мл.

3. Элюирование. Для элюирования через колонку пропускают в общей сложности 700—800 мл буферного раствора со скоростью 40—60 мл/ч и собирают фракции по 5 мл. Оптическую плотность элюата регистрируют либо непрерывно с помощью “Увикорда”, либо спектрофотометрией каждой отдельной фракции при 280 нм.

ПРИМЕЧАНИЯ

1. Белки сыворотки элюируются из колонки с сефадексом G-200 тремя отдельными фракциями. В первую фракцию (соответствующую первому пику) входят высокомолекулярные белки, такие, как макроглобулин и липопротеиды. Вторая фракция (соответствующая второму пику) содержит белки, близкие по молекулярному весу к IgG, а именно иммуноглобулины G и А. В третьей фракции (соответствующей третьему пику) элюируются белки с меньшим молекулярным весом, такие, как альбумин и трансферрин. При фракционировании сывороток больных миеломами IgG- или IgA-типа второй пик получается очень большим. Увеличение же первого пика характерно для макроглобулинемии Вальденштрёма.

2. Для предохранения верхнего слоя геля от взмучивания во время нанесения препарата на поверхность геля можно положить кружок фильтровальной бумаги. При гель-фильтрации на сефадексах G-75, G-100, G-150 и G-200, особенно если фракционированию подвергаются белки, желательно оставлять в колонке над сефадексом немного буферного раствора, а исследуемый материал наносить под него. Это осуществимо, если плотность наносимого препарата больше плотности буферного раствора. Плотность фракционируемого белкового раствора можно увеличить, добавляя к нему соответствующее количество сахарозы.

3. Обычно гель-фильтрацию продолжают до тех пор, пока не элюируются все белки из колонки, поэтому после опыта колонку можно не отмывать. Однако все же рекомендуется перед каждым фракционированием пропустить через колонку несколько объемов буферного раствора.

4. Если колонку предполагается использовать в течение длительного времени, желательно суспендировать сефадекс в буферном растворе, содержащем мертиолат, фенол или толуол, для предотвращения бактериального роста. Сефадексы можно стерилизовать в автоклаве (при 110° С в течение 40 мин) без нарушения их свойств.

5. После того как гель сефадекса набух и отстоялся, следует

тщательно удалить мелкие частицы, плавающие в надосадочной жидкости, так как они могут уменьшать скорость протекания элюента через колонку.    

6. Элюирование можно также проводить раствором 0,1 М трис-НСl pH 8,0, содержащим 1 М NaCl.