Аминокислоты, пептиды и белки - Дэвени Т., Гергей Я. 1976

Тонкослойная хроматография (Д. А. Медьеши)
Тонкослойная хроматография аминокислот и их производных
ДНФ-аминокислоты

Силикагель хорошо зарекомендовал себя в качестве носителя для тонкослойной хроматографии ДНФ-аминокислот.

Примерно 25—30 г силикагеля суспендируют в 60—65 мл дистиллированной воды и растирают в фарфоровой ступке до получения гомогенной массы. Этого количества силикагеля достаточно для 5 пластинок размером 20 x 20 см с толщиной слоя 0,25 мм. Если используют носитель, содержащий сульфат кальция (кизельгель G), растирание и наслаивание его занимает не более 1—1,5 мин. Силикагель, не содержащий сульфата кальция (кизельгель Н), дает стабильный слой толщиной до 0,25 мм. Для хроматографии аминокислот и их производных используют пластинки, высушенные на воздухе без нагревания.

Для фракционирования ДНФ-аминокислот предложено несколько различных методик. Водо- и кислоторастворимые ДНФ-аминокислоты можно разделить с помощью одномерной хроматографии, используя в качестве растворителя смесь н-пропилового спирта и 37%-ного раствора NH₄OH (7 : 3, по объему). Препарат наносят на пластинку в растворе уксусной кислоты или 0,5 н. НСl, однако до начала хроматографии необходимо удалить кислоту. Для этого хроматографическую пластинку перед нанесением нагревают до 60°С и наносят разделяемую смесь на горячий носитель.

Эфирорастворимые ДНФ-аминокислоты также могут быть разделены с помощью двумерной хроматографии на силикагеле в следующих системах растворителей: 1) толуол — пиридин — эти- ленхлоргидрин — 0,8 н. NH₄OH (100 : 30 : 60 : 60), верхняя фаза используется в качестве элюента при хроматографии, нижняя — для предварительной обработки слоя носителя; 2) хлороформ — бензиловый спирт — уксусная кислота (70 : 30 : 3); 3) бензол — пиридин — уксусная кислота (80 : 20 : 2); 4) хлороформ — метанол — уксусная кислота (95 : 5 : 1).

На первом этапе разделения используется система (1). Боковые стенки хроматографической камеры выстилают фильтровальной бумагой, смоченной в нижней фазе этого растворителя. Две стеклянные пластинки покрывают силикагелем и помещают в камеру так, чтобы слой геля был обращен к фильтровальной бумаге, но не контактировал с ней.

Пластинки оставляют в камере до следующего дня, извлекают из камеры и тотчас сверху прикрывают слой адсорбента другой стеклянной пластинкой таким образом, чтобы на одном конце первой пластинки оставалась незакрытой полоска шириной 15 мм. На нее как можно быстрее наносят фракционируемый материал и немедленно погружают пластинку в растворитель [верхняя фаза системы (1)]. После того как фронт растворителя пройдет 15 см, пластинку извлекают из камеры, 3 мин подсушивают на воздухе и вновь погружают в тот же самый растворитель. После второй хроматографии в том же направлении пластинку 10 мин подсушивают струей воздуха, на 10 мин помещают в термостат при 60°С и затем охлаждают в струе воздуха в течение 10—15 мин. После этого сразу же проводят разделение в перпендикулярном направлении. При использовании в качестве элюента систем растворителей (3) и (4) длительная горизонтальная хроматография продолжается 2—3 ч (см. рис. 46).