Підручник - БІОЛОГІЧНА ХІМІЯ - Губський Ю.І. - 2000

Розділ I. БІОМОЛЕКУЛИ ТА КЛІТИННІ СТРУКТУРИ

ГЛАВА 2. БІЛКИ І ПЕПТИДИ

2.5. МЕТОДИ ВИДІЛЕННЯ ТА АНАЛІЗУ БІЛКІВ І ПЕПТИДІВ

2.5.1. Методи виділення та фракціонування білків

Виділення індивідуальних білків із тканин, клітин та біологічних рідин живих організмів (тварин, рослин, бактерій, сироватки крові людини) є розповсюдженою біохімічною та біотехнологічною процедурою, що широко застосовується з метою отримання лікарських засобів (гормонів, ферментів, інтерферонів) або дослідження властивостей певних білків в аналітичній біохімії.

Виділення білків

Для виділення білків із біологічних об’єктів найчастіше використовують їх екстрагування за допомогою різних розчинників, вибір яких залежить від фізико-хімічних властивостей білка або групи білків, яку потрібно отримати. У разі необхідності одержання білків, які локалізовані в певних субклітинних органелах та зв’язані з біоструктурами (мембранами, ядерним хроматином тощо), процедура виділення білка включає в себе:

- руйнування тканинних та клітинних структур (гомогенізація тканини, механічне розтирання, осмотичний шок);

- диференційне центрифугування тканинних гомогенатів із метою отримання ізольованих фракцій ядер, мітохондрій, мембран ендоплазматичного ретикулуму, лізосом тощо;

- переведення білків субклітинних фракцій у розчинний стан шляхом обробки біоструктур детергентами або сольовими розчинниками;

- осадження білків шляхом висолювання або застосування таких дегідратуючих реагентів, як етанол (метод Кона), ацетон.

Фракціонування білків

Результатом зазначених біохімічних процедур є, як правило, отримання екстрактів, в яких міститься значна кількість різних білків та небілкових компонентів. Тому наступним етапом виділення індивідуальних білків є фракціонування білкових сумішей, яке здійснюється на основі відмінностей у фізико-хімічних властивостях індивідуальних білків (молекулярній масі, заряді, розчинності, хімічній та біохімічній активності). Ці ж методи дозволяють проводити визначення і відповідних фізико-хімічних параметрів певних білкових молекул.

Методи фракціонування:

1. Методи, що базуються на відмінностях у молекулярній масі білків:

- метод ультрацентрифугування (седиментаційного аналізу).

Метод ґрунтується на застосуванні швидкісних ультрацентрифуг, за допомогою яких білкові молекули (або інші високомолекулярні сполуки) зазнають дії центробіжного прискорення, що в сотні тисяч разів перевищує прискорення земного тяжіння (100 000-500 000 g). Внаслідок дії значної центробіжної сили, макромолекули осідають (седиментують) із швидкістю, яка залежить від їх розмірів та молекулярної маси.

Визначення швидкості седиментації білкової молекули, яка виражається коефіцієнтом седиментації s, дозволяє обчислити молекулярну масу білка (М) за рівнянням Сведберга:

де R — газова стала, Т — абсолютна температура, D — коефіцієнт дифузії білка, v — парціальний питомий об’єм білка, p — густина розчинника.

- метод гель-фільтрації (гель-хроматографії).

В основу методу покладено відмінності в швидкостях проходження (фільтрації) білкових молекул, що відрізняються молекулярними масами, через спеціальні гелі, які відіграють роль молекулярних сил.

Для гель-фільтрації застосовують полімерні сполуки, найчастіше — похідні полісахариду декстрану (комерційна назва — Сефадекси), що мають форму гранул із порами певного розміру. Під час проходження через хроматографічну колонку, яка містить гранули Сефадексу, суміші білків та інших хімічних сполук, відбувається фракціонування останніх залежно від розмірів молекул та, відповідно, здатності до проникнення в сітку гелю. Швидкість проходження різних молекул через молекулярні сита зворотньо пропорційна їх розмірам та молекулярним масам.

2. Методи, що базуються на відмінностях у кислотно-основних властивостях білків.

Амфіонні властивості білків дозволяють здійснювати їх фракціонування

методами іонообмінної хроматографії та електрофорезу.

Метод іонообмінної хроматографії базується на здатності заряджених молекул білків вибірково зв’язуватися за допомогою іонного обміну з певними ділянками іонообмінників. Фракціонування компонентів білкових сумішей досягається шляхом пропускання буферних розчинів білків при різних значеннях рН через хроматографічні колонки, що містять катіоно- або аніонообмінники.

Із метою хроматографічного розділення білків шляхом іонного обміну найчастіше використовують іонообмінники на основі целюлози: катіонообмінник ді етиламіноетилцелюлозу (ДЕАЕ-целюлозу) або аніонообмінник карбоксиметилцелюлозу (КМ-целюлозу).

3. Методи, що базуються на відмінностях у біохімічній активності індивідуальних білків.

Ця група методів грунтується на використанні різної спорідненості природних білків до певних хімічних лігандів, з якими окремі білкові молекули активно взаємодіють у живих організмах — хроматографія за спорідненістю, або афінна хроматографія (від англ. affinity — спорідненість, нахил).

Для реалізації методу афінної хроматографії суміш білків пропускають через хроматографічну колонку, що містить природні ліганди для білка, який потрібно виділити із складної біологічної суміші. Наприклад, для виділення ферментів застосовують їх специфічне зв’язування із субстратами, гормонів — із рецепторами, імуноглобулінів — із відповідними антигенами.