Биотехнология - Ю.О. Сазыкин 2006

Общая биотехнология
Молекулярные механизмы внутриклеточной регуляции и их использование в биотехнологическом производстве
Ретроингибирование и преодоление этого явления

Метаболические пути, ведущие к синтезу в клетке низкомолекулярных соединений — как первичных, так и вторичных метаболитов, включают, как правило, по нескольку ферментов, участвующих в сборке углеродного скелета метаболита.

Перечень метаболитов и их соотношение во внутриклеточном фонде строго сбалансированы, но в случае изменения условий культивирования клетки эти параметры будут меняться на разных циклах развития клетки. Все это соответствует интересам клетки, но не всегда совпадает с интересами и целями биотехнолога, в соответствии с которыми необходимо добиться максимального синтеза конкретного метаболита. Иногда этот метаболит является целевым продуктом, иногда — его предшественником. Чтобы добиться поставленной цели, следует преодолеть тот механизм внутриклеточной регуляции, который препятствует работе продуцента в интересах биотехнолога. Таким выработанным эволюцией механизмом является ретроингибирование, т.е. подавление конечным продуктом активности первого фермента метаболического процесса.

Анализируя явление ретроингибирования, можно сказать, что эволюция привела к логическому решению жизненно необходимой для клетки задачи. Например, как только концентрация конечного метаболита становится достаточной для удовлетворения нужд клетки, метаболит начинает отрицательно влиять на свой собственный биосинтез. В результате подавляется активность первого фермента, что влечет прекращение образования не только метаболита, но и всех его промежуточных предшественников.

Таким образом, этот механизм регуляции срабатывает очень четко: если клетке в данный момент конечный метаболит не нужен, то не нужны и его предшественники. Поскольку конечный метаболит уже прекратил свое образование, но продолжает расходоваться, естественно, что концентрация ею в клетке понижается. Как только она достигает соответствующего нижнего предела, синтез метаболита быстро начинается вновь из-за того, что метаболит как ингибитор своего биосинтеза взаимодействует (за счет водородных связей) с аллостерическим центром начального фермента метаболической цепочки. Поэтому фермент сохраняет потенциальную способность вновь быстро перейти в активное состояние, что и происходит после освобождения аллостерического центра от ингибитора, вследствие понижения его концентрации.

Биотехнолог может преодолеть механизм ретроингибирования и заставить клетку непрерывно нарабатывать метаболит. Во-первых, можно непрерывно удалять образующийся метаболит из питательной среды и таким образом снижать его внутриклеточную концентрацию. Это достигается внесением в среду сорбента: в результате концентрация растворенного метаболита (целевого продукта) снижается, и механизм ретроингибирования не включается. Во-вторых, можно использовать генно-инженерные методы — сконструировать продуцент с мутацией в аллостерическом центре начального фермента метаболической цепочки. При этом изменения в конформации аллостерического центра должны не меняться под действием ингибитора. В этом случае ретроингибирование уже не будет ограничивать синтез данного метаболита. В-третьих, необходим специальный контроль за составом сред, используемых при ферментации. В них должно быть ограничено количество метаболита (целевого продукта), что предотвратит возможность его отрицательного влияния на собственный биосинтез в клетках продуцента. Весьма иллюстративен пример неудачи при биосинтезе пенициллина (продуцент Penicillium chrysogenum) на комплексной, богатой лизином среде, используемой в качестве добавки к некоторым дешевым и недефицитным комплексным средам. Лизин является первичным метаболитом, пенициллин — вторичным. Одним из предшественников лизина является аминоадипиновая кислота, входящая в состав так называемого LLD-трипептида, из которого в результате ряда последующих реакций формируется молекула пенициллина. Поэтому лизин, подавляя собственный биосинтез но механизму ретроингибирования, одновременно подавляет и биосинтез аминоадипиновой кислоты, а следовательно, и пенициллина (рис. 8). Таким образом, для биотехнологов, работающих в антибиотической промышленности, возникает актуальная задача по подбору сред с ограниченным количеством лизина или создания производственных штаммов Penicillium chrysogenum с нарушенным механизмом ретроингибирования по лизину.

Рис. 8. Схема подавления лизином образования пенициллина:

Ф₁ — начальный фермент метаболической цепочки; Ф₂, Ф₃, Ф₄ — ферменты, включенные в метаболическую цепочку; 1, 2, 3 — предшественники аминоадипиновой кислоты