Биотехнология - Ю.О. Сазыкин 2006

Общая биотехнология
Молекулярные механизмы внутриклеточной регуляции и их использование в биотехнологическом производстве
Регуляция усвоения азотсодержащих соединений

Известно, что в земной атмосфере количественно явно доминирует азот, однако эволюция жизни на нашей планете не пошла по прямому усвоению его клетками млекопитающих, растений и большинства микроорганизмов. Азот воздуха могут использовать только клубеньковые бактерии, развивающиеся в ризосфере бобовых растений, и некоторые свободно живущие азотфиксаторы, что, в свою очередь, обусловливает появление в почве аммонийных солей и оксидов азота.

Многие микроорганизмы усваивают органические соединения азота, однако из широкого многообразия таких соединений наиболее легко и быстро микроорганизмами усваиваются хлорид и сульфат аммония.

Центральными при синтезе азотсодержащих веществ являются реакции метаболизма с участием доноров аминогрупп: глутамата, глутамина и аспартата:

Глутамат + NH₃ + АТФ → Глутамин + АДФ + Ф

Глутамин + а-Кетоглутарат + НАДФН → 2-Глутамат + НАДФН⁺

Глутамат + Оксалоацетат → Аспартат + а-Кетоглутарат

где Ф — фосфор неорганический.

На примере глутаминсинтетазы — важнейшего начального фермента азотного метаболизма, катализирующего переход аммиака в амидную группу (первая реакция), можно показать всю сложность регуляторных взаимодействий в сильно разветвленном метаболическом пути. Амидная группа глутамина является источником азота при биосинтезе шести соединений: двух ароматических аминокислот — триптофана и гистидина, а также АМФ, ЦТФ, глюкозамина-6-фосфата и карбамилфосфата. В опытах на клетках микроорганизма Е. coli показано, что любой из конечных метаболитов, находясь в насыщающей концентрации (имеются в виду потребности микроорганизма), может действовать по принципу ретроингибирования. Однако вызываемое при этом ингибирование неполно. Вместе с тем при росте числа метаболитов (в насыщающей концентрации) проявляется аддитивность, т.е. ингибирование фермента усиливается почти до полного исчезновения его активности, что получило название кумулятивного ретроингибирования. Также установлено, что все метаболиты-ингибиторы глутаминсинтетазы связываются с ферментом в своем определенном месте. Таким образом, при связывании они не мешают один другому, что имеет принципиальное значение для регуляции активности глутаминсинтетазы.

Однако существует и другой механизм регуляции этого сложного, состоящего из 12 субъединиц (молекулярная масса 12 кДа у каждой), фермента. С одной стороны, если культура микроорганизма оказывается в среде крайне бедной источниками углерода и энергии, но с избытком ионов аммония и глутамина, то активность глутаминсинтетазы резко снижается за счет более радикального механизма. Каждая из 12 субъединиц аденилируется, ковалентно связывая по одному остатку АМФ, Активность фермента практически полностью исчезает, что благоприятно для выживания микроорганизма. С другой стороны, при переносе микроорганизма на среду, обедненную легко усваиваемым источником азота, глутаминсинтетаза деаденилируется и «мобилизует» свою активность.

У некоторых микроорганизмов система регуляции глутаминсинтетазы усложняется за счет того, что этот фермент существует в двух изоформах: в случае одной изоформы в систему регуляции включаются аденилирование — деаденилирование, в случае другой — обратимая избытком аммиака инактивация.

Наряду с перечисленными механизмами регуляции активности глутаминсинтетазы существует также еще один механизм внутриклеточной регуляции, позволяющий некоторым микроорганизмам бороться с недостатком азота в питательной среде за счет усиления экспрессии гена глутаминсинтетазы.

Ферменты, участвующие в усвоении азотсодержащих соединений, в большинстве случаев индуцибельны и подвержены закономерностям азотной репрессии, которая проявляется после превращения этих соединений в глутамин. При синтезе глицина и аланина а-аминогруппа глутамина реализуется с участием трансаминаз. При этом степень обеспеченности клетки азотом определяется соотношением глутамина с а-кетоглутаратом. Также на разных клетках эукариот было показано, что дефицит источников углерода и энергии в питательной среде ведет к заметной протеолитической деградации ферментов, включенных в использование азотсодержащих соединений.

Регуляция усвоения азотсодержащих соединений у эукариот, прежде всего грибов, включая дрожжи, имеет много общего с прокариотами, хотя есть и отличия. Например, для грибов предпочтительнее использовать в качестве источника азота соли аммония и глутамин.

В задачи биотехнолога входит интенсификация реакций биосинтеза глутамина, глутамата и аспартата, что достигается генетическими методами или подбором питательных сред. При получении рада первичных метаболитов, предшественниками которых и являются указанные вещества, интенсификация этих реакций благоприятно сказывается на производственных процессах. Известно, что первичные метаболиты составляют основу разнообразных классов лекарственных агентов. Вместе с тем, так как вторичные метаболиты, как правило, являются модификацией первичных, интенсификация биосинтеза последних положительно сказывается и на биосинтезе вторичных метаболитов, например, многих антибиотиков, особенно тех, в структуру которых входят пептиды.