Биотехнология - Ю.О. Сазыкин 2006

Частная биотехнология
Биотехнология лекарственных средств на основе культур растительных клеток и тканей
Трансгенные растения

Возможности современной биотехнологии в отличие от традиционных методов генетики и селекции позволяют комбинировать гены разных биологических видов и получать трансгенные растения. Трансгенными называются растения тех видов, в которых успешно функционируют гены (или ген), пересаженные из растений или животных других видов. Делается это для того, чтобы растение-реципиент получило новые удобные для человека свойства: повышенную устойчивость к вирусам, гербицидам, вредителям и болезням растений. Пищевые продукты, полученные из таких генноизмененных культур, могут иметь улучшенные вкусовые качества, лучше выглядеть и дольше храниться. Также часто такие растения дают более богатый и стабильный урожай, чем их природные аналоги.

Если взять гены устойчивости к заболеваниям — из вирусов, морозоустойчивости — из рыбы, сопротивляемости вредителям - из бактерий и внести этот «коктейль» в геном какого-нибудь растения, то такая комбинация придаст растению совершенно новые свойства, хотя его биологический вид не изменится. Картофель останется картофелем, просто теперь он станет неуязвимым для колорадского жука. Уже получены: морозоустойчивая свекла, светящаяся в сумерках газонная трава и даже банан, съев который, получаешь «прививку от тропических болезней».

Поиски путей введения чужеродных генов в клетки высших растений интенсивно ведутся во всем мире с 1970-х гг. Было обнаружено, что опухолеобразующие Ті-плазмиды агробактерий (Ті — tumor inducing), представляющие миникольцевые ДНК, являются великолепной природной векторной системой, которую в настоящее время используют для переноса генов в растения. Плазмида содержит тДНК (transferred DNA), состоящую из 12 —22 тыс. пар оснований и кодирующую ферменты синтеза фитогормонов и опинов — производных аминокислот, которые используются бактерией как источник углерода, азота и энергии. Кроме тДНК, в Ті-плазмиде содержатся: vir-область, отвечающая за перенос тДНК в растение, гены утилизации опинов, а также локусы, контролирующие размножение плазмиды в бактериальной клетке и ее перенос при бактериальной конъюгации. Плазмида агробактерии переносит часть своей ДНК в ДНК растительной клетки, т. е. в ДНК последней встраивается «нужный» ген.

Весь процесс вырезания и интеграции тДНК в растительную хромосому осуществляют продукты генов, локализованных в vir-области. Индукция vir-генов обратима, что очень важно для патогена: в случае, если хозяин — больной и нежизнеспособный организм, перенос тДНК не осуществляется. Внедрение тДНК в растительный геном является многоступенчатым процессом, при этом в геном растения могут встраиваться несколько копий тДНК.

После встраивания в хромосому тДНК становится обычной частью генома растения и транскрибируется в растительных клетках РНК-полимеразой растения-хозяина. Сама бактерия в клетку не проникает, а остается в межклеточном пространстве и использует растительные клетки со встроенной тДНК как фабрику, продуцирующую опины.

тДНК Ті-плазмид обладает двумя свойствами, делающими ее по существу идеальным вектором для введения чужеродных генов в клетки растений. Во-первых, круг хозяев агробактерий очень широк: они трансформируют клетки практически всех двудольных растений (иногда даже однодольных, в том числе злаков). Во-вторых, интегрированная в состав генома растения тДНК наследуется как простой доминантный признак в соответствии с законами Менделя, а ее гены имеют собственные промоторы (регуляторная область гена, определяющая время и место его экспрессии), под контролем которых могут экспрессироваться вставленные в тДНК чужеродные гены. В целом идеальная векторная система на основе Ti-плазмиды должна содержать все сигналы, необходимые для переноса и стабильной интеграции в ядерную ДНК растений, систему для экспрессии чужеродных генов в растениях (узнаваемый растительными полимеразами регулируемый промотор), маркер (репортерный ген), который необходим для селекции трансформированных клеток и не содержать онкогенов, т.е. генов, которые подавляют дифференцировку растительных клеток.

Сейчас используют широкий арсенал методов для получения трансгенных растений. Одним из способов введения тДНК в клетки растения является использование бинарных векторных систем, создание которых заключается в том, что агробактериальная клетка должна содержать по крайней мере две разные модифицированные Ti-плазмиды. Одна из них должна содержать только vir-область, гены которой будут участвовать в вырезании тДНК. Такие плазмиды называют плазмидами-помогцницами. Вторая Тi-плазмида должна содержать область тДНК с нужным встроенным геном. Продукты vir-генов способны вырезать тДНК как на собственной плазмиде, так и на соседней, т.е. vir-гены могут работать вне зависимости от их местоположения.

Таким образом, если клетки агробактерии содержат Ті-плазмиду с сегментом vir и другую плазмиду с тДНК, несущей встроенный ген, эти бактерии могут трансформировать клетки растений. Существуют и другие способы введения чужой ДНК в клетки растения. Например, можно ферментами растворить толстую клеточную оболочку растительной клетки, мешающую прямому проникновению чужой ДНК, поместить такие очищенные клетки в раствор, содержащий ДНК и какое-либо химическое вещество, способствующее проникновению ДНК в клетку (чаще всего применяется полиэтиленгликоль).

Иногда в мембране клеток короткими импульсами высокого напряжения проделывают микроотверстия, через которые в клетку могут проходить отрезки ДНК. В некоторых случаях применяют даже непосредственно «впрыскивание» ДНК в клетку микрошприцем под микроскопом. Несколько лет назад предложено покрывать молекулами ДНК сверхмалые металлические «пули», например шарики из вольфрама диаметром 1—2 мкм, а затем из специального прибора «Shotgun» «стрелять» ими в растительные клетки. Проделываемые в стенке клетки отверстия быстро заживляются, а застрявшие в протоплазме «пули» так малы, что не мешают клетке функционировать. Часть «залпа» приносит успех — некоторые «пули» внедряют свою ДНК в нужное место, осуществляя таким образом трансформацию растительных клеток.

В последние годы ученые используют новый подход для получения трансгенных растений с «antisense RNA» (перевернутой или антисмысловой РНК), который позволяет управлять работой интересуемого гена. В этом случае при конструировании вектора копию ДНК (кДНК) встраиваемого гена переворачивают на 180 град. В результате в трансгенном растении образуется нормальная молекула мРНК и перевернутая, которая в силу комплементарности нормальной мРНК образует с ней комплекс, и кодируемый белок не синтезируется.

Такой подход был использован для получения трансгенных растений томатов с улучшенным качеством плодов. В вектор была включена кДНК гена PG, контролирующего синтез полигалактуроназы (polygalacturonase) — фермента, участвующего в разрушении пектина, основного компонента межклеточного пространства растительных тканей. Продукт гена PG синтезируется в период созревания плодов томатов, а увеличение его количества приводит к тому, что томаты становятся более мягкими, что, в свою очередь, значительно сокращает срок их хранения. Отключение этого гена позволило получить растения томатов с новыми свойствами плодов, которые не только значительно дольше сохранялись, но и сами растения были более устойчивы к грибным заболеваниям.

Наиболее остро стоит вопрос о получении растений, устойчивых к вредителям сельского хозяйства (прежде всего к фитопатогенным грибам и насекомым), так как болезни растений стали основным лимитирующим фактором получения урожая. Было обнаружено, что устойчивость растений к вредителям можно запрограммировать генетически — введением в геном растений чужеродных генов, продукты которых вызывают гибель вредителя. Традиционно для этого используют ген bt, продуктом которого является бактериальный токсин, продуцируемый бактерией Bacillus thuringiensis. Этот крупный белок (протоксин), контролируемый геном bt, попадая в кишечник личинок насекомых, разрушается под действием ферментов, а его фрагмент (эндотоксин) приводит к гибели насекомых. Трансгенные растения картофеля, хлопка, кукурузы с геном bt уже производятся фирмами «Monsanto», «Сibа Seeds» и успешно продаются на мировом рынке.

Известно, что растения, подобно животным, способны вырабатывать иммунитет. Однако этим замечательным свойством обладают только устойчивые растения, у которых при атаке патогенов резко меняется метаболизм. В результате у этих растений накапливаются такие химические соединения, как пероксид водорода, салициловая кислота и фитоалексины. Повышенное содержание этих соединений способствует противостоянию растения в борьбе с патогенами. Например, трансгенные растения табака, которые содержат бактериальный ген, контролирующий синтез салицилата гидролазы (этот фермент разрушает салициловую кислоту), были неспособны к иммунному ответу. Поэтому изменение генно-инженерным путем уровня салициловой кислоты или выработки в растениях в ответ на патоген пероксида водорода может быть перспективным для создания устойчивых трансгенных растений.

Многообещающим направлением в генной инженерии растений является получение трансгенных растений, содержащих комбинацию определенных гормональных генов бактерий. Оказалось, что плоды некоторых из таких трансгенных растений являются партенокарпическими, т.е. сформировавшимися без опыления. Эти плоды характеризуются либо полным отсутствием семян, либо очень небольшим их количеством, что позволяет решить проблему «лишних косточек», например в арбузе, у цитрусовых и т.д. Уже получены трансгенные растения кабачков, которые в целом не отличаются от контрольных, но практически не содержат семян.

Во всем мире активно ведутся работы по созданию на основе трансгенных растений так называемых «съедобных вакцин», которые в дальнейшем можно будет использовать для предупреждения наиболее опасных болезней человека. Например, учеными СО РАН успешно ведется разработка противотуберкулезной вакцины. При создании вакцины ученые используют гены человека, кодирующие синтез специфических антител к белкам возбудителя болезни — Mycobacterium tuberculosis. Эти антитела и обеспечиваютиммунитет к данному заболеванию. Гены, кодирующие антитела против туберкулеза, встроили в геном растительных клеток. Из клеток, в которых удачно произошло встраивание защитных генов, регенерировали полноценные растения, которые обладают способностью синтезировать антитела против туберкулеза.

Традиционные методы лечения туберкулеза не всегда безвредны и эффективны, и ученые надеются, что использование трансгенных растений дает шанс не только избавиться от болезни, но и избежать побочных эффектов. Также в Институте физиологии и биохимии растений СО РАН создается вакцина против СПИДа, гепатита на основе трансгенеза томата и огурца. Группе немецких ученых-генетиков из Giessen University во Франкфурте удалось вырастить генетически модифицированную морковь, которая содержит вакцину против гепатита В, что позволяет значительно снизить затраты на профилактику этого заболевания (по официальной статистике ВОЗ около 350 млн человек в мире инфицированы вирусом гепатита В, который приводит к тяжелым повреждениям печени, хронизации процесса и смертельным исходам, ежегодно унося 1 млн человеческих жизней). Трансгенная морковь может расти в разных климатических поясах и на разных грунтах, хорошо хранится, транспортируется, может употребляться в сыром виде. Потребляя этот продукт с пищей, человек как бы постоянно вводит вакцину маленькими дозами, чем поддерживает активность иммунитета к вирусу гепатита В.

Крупнейшим в мире производителем и потребителем трансгенных растений являются США, лидирующие как по площадям посевов, так и по степени принятия обществом трансгенной пищи. Повсеместное использование там генетически модифицированных растений (от общего количества, взятого за 100 %) составляет: 40 % выращиваемой в стране кукурузы, 81 % сои, 65 % канолы (рапса) и 73 % хлопка, и оно продолжает расти. Получением и испытанием таких растений занимаются сотни коммерческих фирм с совокупным капиталом более 100 млрд долл.

На сегодня лидером по выращиванию трансгенного хлопка, устойчивого к насекомым, является Китай. В Аргентине, правительство которой поддерживает выращивание генетически модифицированных культур, доля трансгенной сои составляет 90%, а кукурузы и хлопка — 50 %.

Южно-Африканская Республика — единственная африканская страна с масштабными посадками трансгенных культур — 80% хлопка, 20 % кукурузы и11% сои здесь генетически модифицированы. Остальную часть Африки агробиотехнологические фирмы рассматривают прежде всего как полигон будущих испытаний. Япония одним из приоритетов своего научного бюджета сделала агробиотехнологию, несмотря на то, что применение генетически модифицированных продуктов встречает здесь сильное сопротивление общественности.

В Европе после принятия ЕС в 1998 г. правил применения генетически модифицированной продукции Франция, Италия, Дания, Греция и Люксембург запретили эти продукты. Сейчас ЕС принял новые правила сертификации и маркировки последних и значительно смягчил свою позицию. Однако только в Испании в незначительных объемах выращивают трансгенную кукурузу. В России к выращиванию на полях не разрешено ни одно трансгенное растение.

Исключение составляет трансгенная соя, и то только в качестве пищевого сырья или компонента продуктов (ее можно есть, но не выращивать).

Несмотря на потрясающие успехи биотехнологии по созданию трансгенных растений с одновременным проведением всех необходимых тестов на токсичность, аллергенность, мутагенность, в обществе существует настороженное отношение к генетически модифицированным продуктам. Есть вполне реальные опасения по поводу того, что пыльца и семена трансгенных растений и сорняков могут скреститься и в конечном счете вырастет такой суперсорняк, который не сможет уничтожить ни один гербицид.

Вместе с тем неконтролируемое распространение («горизонтальный перенос») чужеродных генов в популяции культурных, традиционных сортов и дикорастущих форм растений может привести к нарушению равновесия в биоценозах, а также к засорению традиционных сортов трансгенными вставками и в дальнейшем к их полному уничтожению. Улучшение питательных свойств картофеля, кукурузы, сои может стать причиной тяжелых аллергических реакций у человека. Некоторые ученые высказывают серьезную обеспокоенность по поводу возможности образования новых вирулентных штаммов в результате генетической рекомбинации между трансгенами и генами природных вирусов.

Контрольные вопросы

1. Какие проблемы производства лекарственных средств решаются при использовании культур клеток растений?

2. Какова специфика растительных клеток, определяющих условия их культивирования при получении лекарственных средств?

3. Каковы особенности роста растительных клеток в культурах и как это влияет на выход конечного продукта?

4. Какова специфика питательных сред для культур растительных клеток?

5. Какова роль биотрансформации (биоконверсии) при получении лекарственных средств на основе культур растительных клеток?

6. Каковы преимущества иммобилизации растительных клеток при получении на их основе лекарственных веществ?

7. Какие существуют формы и методы иммобилизации растительных клеток и в чем заключается сложность иммобилизации растительных клеток по сравнению с клетками микроорганизмов?

8. Каковы перспективы развития биотехнологии в получении лекарственных средств на основе культур растительных клеток?

9. Какие основные методы получения трансгенных растений существуют?

10. Могут ли трансгенные растения использоваться для получения лекарственных средств?