Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аффинная хроматография белков
Методы приготовления аффинного сорбента
Материалы-носители

Носитель должен быть устойчив к действию биологических и химических факторов. В качестве носителей обычно используют агарозу, целлюлозу, полиакриламидные гели и пористое стекло (кремнезем).

5.3.2.1. Агароза. Агароза — линейный полисахарид, содержащий остатки D-галактозы и 3,6-ангидро-ь-галактозы. Это наиболее распространенный носитель для аффинной хроматографии, обладающий рядом необходимых характеристик, в частности, агароза достаточно стабильна в обычных условиях. Кроме того, агароза выпускается в виде хорошо стандартизованного препарата.

Лиганды и пространственные группы легко присоединяются к агарозе после активации бромоцианом. В литературе приводится ряд модификаций этой методики. Активацию бромоцианом проводят в буферном растворе или в диметилформамиде. В процессе активации поддерживают pH 9—10, подтитровывая щелочью или концентрированным буферным раствором. Для лабораторий, не подготовленных к работе с токсичным бромоцианом (отсутствие приточно-вытяжной вентиляции и вакуумных насосов), выпускается бромоцианактивированная агароза. Однако этот коммерческий препарат не свободен от недостатков. Отметим некоторые из них;

1) Биодеградация. Агароза легко разрушается гидролитическими ферментами бактерий, присутствующих в исследуемых растворах. В качестве ингибитора протеаз используют 0,02%-ный раствор азида натрия.

2) Химическая деградация. Имеются сведения о том, что химическая связь между носителем и пространственной группой или лигандом гидролизуется под действием аминов, например в присутствии триссодержащих буферов. Аффинный сорбент может также разрушаться в кислой среде при элюировании прочно сорбированных белков.

3) Неспецифическая сорбция. Этот недостаток связан со способом активации. Обработка бромоцианом приводит к активации множества гидроксильных групп, однако не все они доступны для молекул лиганда. Избыточные гидроксильные группы инактивируют избытком первичного амина, лизина, этилен- диамина. Несмотря на это, может иметь место неспецифическое связывание. Нековалентная сорбция наблюдается также при нанесении на колонку концентрированных растворов белков, например сывороток, экстрактов клеток или семян. Для уменьшения неспецифической сорбции рекомендуется промывать сорбент концентрированными солевыми растворами, однако это может привести к десорбции белков, имеющих низкое сродство к лиганду.

5.3.2.2. Целлюлоза. Этот гетерогенный полимер глюкозы благодаря более низкой неспецифической сорбции, а также наличию простых методов иммобилизации лигандов часто используется для получения иммуносорбентов. Однако по гидродинамическим свойствам целлюлоза уступает другим носителям.

5.3.2.3. Полиакриламид. Преимуществом полиакриламида является низкая неспецифическая сорбция белков. Однако могут возникнуть трудности на стадии введения пространственных групп или конденсации с лигандом.

5.3.2.4. Пористое стекло. Пористое стекло с различным размером гранул и разнообразной пористостью доступно как коммерческий препарат. Оно обладает достаточно высокими механическими свойствами и проницаемостью, однако характеризуется недостаточной химической устойчивостью, особенно в щелочной среде. Кроме того, в большинстве случаев при хроматографии на пористых стеклах наблюдается неспецифическая сорбция.

5.3.2.5. Нерастворимые белки. Одним из первых типов аффинных сорбентов является полимер, полученный добавлением этилхлороформиата к раствору белка, содержащего лиганд. При перемешивании реакционной смеси на магнитной мешалке выпадает нерастворимый гель в виде мелких частиц [1]. Для повышения гидродинамических свойств гель можно смешать с крупной фракцией сефадекса G-75.