Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аффинная хроматография белков
Общие приемы аффинной хроматографии
Иммобилизованные субстраты, ингибиторы и кофакторы ферментов

Оптимальными лигандами для аффинной хроматографии ферментов являются соответствующие субстраты, однако в общем случае их применению мешает быстрое превращение в продукты ферментативной реакции и как следствие снижение эффективности и деструкция сорбентов. Тем не менее субстраты могут быть использованы в качестве лигандов, если при определенных условиях скорость каталической реакции понижена, а связывание с ферментом остается достаточно сильным. Такие условия могут быть созданы путем понижения температуры (от —2 до —50°С), когда прочность фермент-субстратного комплекса достаточна для удерживания фермента на колонке, в то время как его десорбция легко достигается при повышении температуры [5].

В более общем случае лигандами служат ингибиторы, а также эффекторы, не затрагивающие при связывании активный центр фермента. Весьма специфическим ингибитором иногда может служить иммобилизованный субстрат. Выбор того или иного ингибитора полностью зависит от соотношения скоростей его ассоциации и диссоциации с ферментом, что определяет условия проведения адсорбции и десорбции.

Для того чтобы избежать необходимости синтеза новых и новых сорбентов, всякий раз, когда требуется выделить тот или иной индивидуальный фермент, были проведены поиски «универсальных» аффинных лигандов. Наиболее подходят для этой цели адениннуклеотидные коферменты, такие, как 5'-АМР, 2',5'-ADP, NAD⁺, NADP⁺, поскольку примерно третья часть из 2000 известных ферментов проявляют активность в присутствии кофакторов указанного типа. В качестве структурного аналога NАD⁺-содержащих носителей для синтеза сорбентов с групповой специфичностью был использован голубой декстран.

Характерно, что применение групповых лигандов способствовало лучшему пониманию механизма действия кофакторов, а также влияния солей и сопутствующих белков, определяющих силу биоспецифического взаимодействия и условия адсорбции и элюирования фермента. Таким образом, несмотря на сравнительно низкую специфичность групповых лигандов, путем подбора соответствующих условий можно достичь высокой степени очистки выделяемого фермента.

Изящный вариант «каскадной» методики такого типа был продемонстрирован недавно на примере выделения цитрат-синтетазы (К. Ф. 4.1.3.7) и фумаразы (К. Ф. 4.2.1.2) с использованием одной и той же аффинной колонки, содержащей пиромеллитовую кислоту (ПМК), присоединенную к сефарозе 4В через пространственную группу диаминопропанола. Экстракт ткани наносят на колонку с ПМК-сефарозой 4В в 0,01 М фосфатном буфере (pH 7,3), содержащем 0,01 М меркаптоэтанол. Цитрат-синтетаза сорбируется полностью, в то время как связывание фумаразы в присутствии фосфата подавляется (фосфат — конкурентный ингибитор этого фермента). Цитрат-синтетазу элюируют тем же буфером, содержащим 0,01 М лимонную кислоту. Полученный элюат наносят на колонку с гелем голубой сефарозы 4В, где фермент связывается количественно, и далее элюируют 0,01 М фосфатным буфером (pH 7,3), содержащим меркаптоэтанол (но не содержащим лимонной кислоты). Фракцию фумаразы, не сорбированную на ПМК-сефарозе 4В в условиях элюирования фосфатом и содержащую 100% ферментативной активности, подвергают диализу против 0,01 М трис-ацетатного буфера (pH 7,3), содержащего 0,014 М меркаптоэтанол и наносят на колонку с ПМК-сефарозой 4В в указанном буфере. При этом наблюдается количественное связывание фермента, элюирование которого проводят в присутствии L-яблочной кислоты и далее, после удаления последней, фумаразу сорбируют на колонке с голубой сефарозой, а затем проводят элюирование, вновь добавляя яблочную кислоту в рабочий трис-ацетатный буфер.