Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Разделение смесей белков и пептидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Гель-хроматография
Параметры разделения

При использовании мягких гелей (сефадекс, биогели) разделение по размерам молекул занимает много времени. Появление жестких носителей для гель-хроматографии дало возможность сократить время, необходимое для разделения белков и пептидов этим методом. Применение сорбентов, устойчивых к сжатию (ультрагель, сефароза), помогло добиться большей эффективности разделения, проводимого в обычных (насыпных) колонках.

Для получения носителей, обладающих параметрами, необходимыми для высокоэффективной гель-хроматографии, фирмы-производители ищут способы получения сорбентов в форме однородных частиц малого диаметра (5—10 мкм), имеющих небольшой разброс размера пор (не более нескольких процентов).

Поведение белка (пептида) в ходе гель-хроматографии зависит от физических и химических свойств образца, элюента и, конечно, типа используемого носителя.

Обзор физических параметров разделения можно найти в работах [19, 33]. Рассмотрим основные понятия гель-хроматографии. Общий объем подвижной фазы V_tскладывается из объема внутри частиц Vi и объема, заключенного между частицами сорбента V₀, упакованного в колонке. Перемещение растворителя внутрь пор и наружу происходит по законам диффузии. Распределение растворенного вещества между внутренним и внешним объемами растворителя определяется коэффициентом распределения К_D:

K_D = V_e- V₀/ V_i = (V_e - V₀)/(V_t - V₀) где V_t, — объем элюирования данного вещества, V₀ — свободный объем (занимаемый жидкостью между частицами носителя), V_t — общий объем подвижной фазы.

Молекулы, размер которых не позволяет им проникать в поры сорбента и вступать в равновесие с жидкостью, находящейся в порах (K_D = 0), элюируются в объеме V_e = V₀. Небольшие молекулы, проникающие в поры (K_d =1), выходят из колонки в виде одного пика в объеме V_e, pавном общему объему V_t.

Ко может меняться в пределах

Большие молекулы проходят через колонку быстрее маленьких, о идеальном случае минимальный объем элюирования равен V₀, а максимальный — V₀ + V_і. Свободный объем V0 можно найти экспериментально, пропуская через колонку вещества, размер молекул которых не позволяет проникать в поры, например ферритин (М 467∙10³) или декстран голубой (М 2 ∙10⁶). Общий объем V_t можно определить, хроматографируя инертные низкомолекулярные вещества ([¹⁴С]глюкозу или ³Н₂O), не взаимодействующие с матрицей носителя. Следует помнить, что использование небольших пептидов или модифицированных аминокислот (например, ДНФ-Lys) для измерения V_t может привести к неверным результатам из-за взаимодействия этих веществ с сорбентом. Степень разделения К двух веществ описывается следующим уравнением (р — ширина пика):

Эффективность колонки оценивается с помощью такого понятия, как высота, эквивалентная теоретической тарелке (ВЭТТ). Этот термин заимствован из теории процессов разделения, которые можно провести в виде отдельных стадий.

Поскольку в хроматографическом процессе фазы находятся в постоянном движении, то высоту колонки, эквивалентную теоретической тарелке, определяют лишь расчетным путем. ВЭТТ или общее число теоретических тарелок вычисляют по результатам хроматографии эталонных соединений. Фирмы, производящие колонки, часто используют в качестве эталонов вещества, отличающиеся от применяемых в лаборатории. Число теоретических тарелок зависит от природы используемого эталона, характеристик колонки, рабочих условий; поэтому сравнивая колонки разных фирм, надо проявлять осторожность при оценке опубликованных результатов разделения. По мере разработки все более эффективных коммерческих сорбентов и методов упаковки ВЭТТ уменьшается, что повышает общее число тарелок в колонке.

В уширение полосы вносят вклад несколько физических факторов (относительно химических см. разд. 6.2.2); среди них — линейная скорость подвижной фазы, вихревая диффузия, вызываемая нарушением потока фазы по мере прохождения через слой частиц, продольная диффузия. Использование частиц малого размера (5—10 мкм), имеющих незначительный разброс по диаметру частиц и по размерам пор, в сочетании с хорошей упаковкой колонки помогает уменьшить размывание зон. Последнее явление вызывается также пристеночными эффектами, и поэтому увеличение диаметра колонки до 7,5—8,0 мм снижает влияние этих эффектов. При выборе колонки надо искать компромисс между стоимостью упакованного носителя и размерами колонки (длина, диаметр).

Поскольку коэффициент диффузии для больших белков существенно меньше, чем для пептидов, то для белков увеличение линейной скорости подвижной фазы гораздо сильнее влияет на ширину зоны и на эффективность колонки, чем в случае пептидов. Увеличение длины колонки положительно сказывается на ее эффективности только при оптимальной скорости потока (относительно кажущегося размера молекул анализируемых соединений). Колонки для гель-фильтрации, производимые разными фирмами, имеют различные (рекомендуемые фирмами) оптимальные скорости потока для разделения смеси одних и тех же белков. Например, в инструкции фирмы Toyo Soda для колонки Blue column, продаваемой фирмой LKB, рекомендуемая скорость потока составляет ~0,05 мл/мин. Такую малую скорость подачи растворителя не могут обеспечить большинство насосов многих фирм, и работа при таких объемных скоростях ведет к удлинению времени анализа. Оптимальная скорость для колонки 1-125 (фирмы Waters) составляет 0,25 мл/мин (по опыту нашей лаборатории). На разделяющую способность влияет также отношение общего объема пор V_i к свободному объему колонки V₀: чем больше отношение V_i/V₀, тем лучше разделение. Проще всего для увеличения отношения V_i/V₀ удлинить колонку; для большинства разделений длина колонки 600 мм оказывается достаточной. При приобретении колонок для гель-фильтрации рекомендуется сравнивать продукцию разных фирм, используя указанное отношение.