Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Разделение смесей белков и пептидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Обращенно-фазовое разделение пептидов
Выбор состава подвижной фазы

Состав подвижной фазы должен отвечать требованиям, предъявляемым к условиям выделения и состоянию очищенного препарата.

1. Следует учитывать спектральные свойства элюента. Пептидная связь поглощает при 206—215 нм, поэтому можно количественно оценивать элюирование всех пептидов. При выборе состава подвижной фазы обязательно следует учитывать это обстоятельство. Органические кислоты довольно прозрачны при 206—215 нм, хотя при их высокой концентрации наблюдается подъем уровня базовой линии из-за поглощения света этими соединениями. Конкретный растворитель можно выбрать, пользуясь справочными таблицами, опубликованными в проспектах фирм или в учебниках. Чаще всего применяют ацетонитрил, метанол, н-пропанол, этанол. Чистота растворителя влияет на смещение базовой линии, происходящее при градиентном элюировании. Выпускаются растворители, позволяющие работать при длине волны 200—215 им.

2. Необходимо принимать во внимание размер, заряд, гидрофобность пептидов. До последнего времени разделение больших пептидов (содержащих более 30—40 остатков) проводили по размеру молекул. На ОФ-носителях пептиды разделяются благодаря гидрофобным взаимодействиям, поэтому увеличение гидрофобности пептидов вызывает увеличение времени удерживания. Поскольку диапазон pH ограничен областью 2,0—7,5 (из-за неустойчивости носителя к гидролизу), то изменение pH буфера влияет в основном на карбоксильные и а-аминогруппы пептидов, Поэтому при рН<рІ боковых цепей Asp и Glu возрастет гидрофобность пептида, так как карбоксилы боковых цепей будут в основном незаряженными. Гидрофобность пептидов можно изменять, используя ионно-парные взаимодействия заряженных боковых цепей. Например, при pH 4 соли аммония образуют ионную пару, что позволяет подавить ионные взаимодействия карбоксильных групп. Ионно-парные взаимодействия с анионами или катионами боковых цепей используют как для повышения, так и для понижения полярности пептидов. Время удерживания на колонке пептида, вступившего в ионно-парное взаимодействие, зависит от способности комплекса к участию в распределительной хроматографии или от адсорбции ионно-парного реагента неподвижной гидрофобной фазой, что приводит к ионообменным взаимодействиям.

Для большинства разделений бывает достаточно использовать фазы, содержащие ТФУ, фосфорную кислоту или ацетат аммония. В особых случаях (например, разделение смесей пептидов, имеющих повышенное содержание кислых групп) используют более сложные ионно-парные системы [4].

3. Если необходимо отделить пептид от всех сопутствующих компонентов раствора, то вместо обессоливания, сопровождающегося большими потерями образца, следует проводить лиофилизацию. При этом обычно отдают предпочтение легко удаляемым в вакууме ацетату и бикарбонату аммония, формиату триэтиламмония, ТФУ, ГФМК, муравьиной и уксусной кислотам.

4. Условия выделения образца не должны мешать последующему определению его свойств. Для проведения многих видов биоиспытаний необходимо удалить органические растворители. Обычно это делают испарением в токе азота. Следует следить за тем, чтобы присутствующие соли и pH раствора не влияли на проведение испытаний.