Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аналитические методы
Ацетильная и формильная группы

После первого сообщения о выделении N-ацетилированного пептида из N-концевого участка белка вируса табачной мозаики [273] обнаружено значительное число белков с блокированными а-аминогруппами. N-Ацетилировапные остатки аланина, аспарагиновой кислоты, глицина, серина, треонина идентифицированы у белков, выделенных из различных источников [47, 81]; см. также обзоры [2 и 406].

С N-формилметионина начинается синтез белковой цепи па рибосоме, формилвалин и формилглицин расположены на N-конце у грамицидина А [325] и меллитина [203]. Описано спонтанное N-формилирование формальдегидом остатков L-лизина [371].

Для установления природы ацилирующего остатка в белках применялись различные методы. Так, ацетильная группа определялась с помощью ферментативных методов [135, 201, 204, 319, 346, 354], колориметрически в виде комплекса с гидроксаматом железа [227], перегонкой с паром с последующим титрованием [7, 183], идентифицировалась в форме ацетогидразида и 1-ацетил-2-ДНФ-гидразида [301] или 1-ацетил-2-даисилгидразида [329]. Применение ферментативных методов предполагает наличие у исследователя высокоочищенных препаратов соответствующих ферментов и требует, как правило, значительных количеств субстрата (100 нмоль ацетата в образце), хотя описана методика определения ацетата на уровне 3—12 нмоль/мл с флуоресцентной детекцией [135].

Формильная группа определялась колориметрическим методом (по Баркеру и Замерсу) после реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой, приводящей к образованию хромофорной группы с λ_mах = 450 нм (фосфаты и уксусная кислота не мешают определению). Зависимость поглощения от концентрации линейна в диапазоне 1 —10 ммоль, но чувствительность определения низкая [113].

Если N-концевой участок белка удается выделить в виде короткого пептида, то содержание в нем ацетилированной аминокислоты может быть определено после гидролиза хроматографическим или электрофоретическим анализом [414]. Для установления природы блокирующего остатка и одновременно аминокислотной последовательности пептида наиболее надежен прямой масс-спектрометрический метод (на анализ требуется — 50 пмоль пептида) (гл. 19), [6].

Разработано несколько методик определения ацетильных групп в белках с помощью ГЖХ [45, 154, 164, 332, 389, 390] и пиролиза [402]. Однако при газожидкостном анализе могут возникать «хвосты» уксусной кислоты на колонке, «фальшивые» пики, а также наблюдаться низкий ответный сигнал детектора.

Предложено отщеплять ацетильную и формильную группы щелочным гидролизом белка [54], так как при кислотном гидролизе образуются свободные уксусная и муравьиная кислоты и их потери в дальнейшем неизбежны. После щелочного гидролиза соли этих кислот превращаются в фенациловые эфиры при катализе краун-эфирами (дициклогексил-18-краун-6). Для обнаружения фенациловых эфиров пламенно-ионизационным детектором содержание ацильных групп в образце должно быть достаточно высоким (—20 нмоль). До настоящего времени остается проблемой более полное использование чувствительности метода ГЖХ, поскольку в обычных условиях возможна инжекция в колонку лишь небольшой части полученного производного образца. В описываемом случае в колонку вводилось 1—2 нмоль фенацилового эфира. Более эффективны в этом отношении пен тафторобепзиловые (ПФБ) эфиры, чувствительность определения которых выше благодаря возможности использования детектора электронного захвата.