Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аналитические методы
Газожидкостная хроматография аминокислот

Аминокислоты могут быть превращены в летучие производные и затем проанализированы с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Существует единственный метод одностадийной модификации — триметилсилилирование, разработанный для качественного и количественного анализа всех белковых аминокислот [119, 121]. Серьезный недостаток метода заключается в том, что некоторые аминокислоты образуют мультиплетные пики; однако этим методом удается определить Asp и Glu в присутствии Asn и Gln.

Наиболее удачные варианты метода включают две стадии:

1) этерификацию карбоксильных групп и 2) ацилирование других реакционноспособных групп (амино-, гидрокси-, сульфгидрильных, гуанидино-). В табл. 8.2 приведены производные аминокислот, которые, как было показано, дают наилучшие результаты при разделении ГЖХ.

Подробному рассмотрению анализа аминокислот методом: ГЖХ посвящены ряд отличных обзоров [28, 30, 170, 229, 395] и специальная монография [422].

При освоении этого метода нетрудно получить удовлетворительные качественные результаты, но достижение корректной количественной их оценки требует большей настойчивости. Ряд осложнений может возникнуть, в частности, с определением гистидина, аргинина, цистина, которые разрушаются па некоторых стационарных фазах [90, 123]. Наиболее интенсивно количественные исследования проводились Герке и его группой с н-бутиловыми эфирами трифтороацетиламинокислот и Маккензи и Танашук, изучавшими изобутиловые эфиры гептафторобутирил-аминокислот. Методики синтеза последних соединений, с которыми приходилось работать автору, приведены ниже.

РИС. 8.8. Анализ методом Pico-Tag™ смеси аминокислот (250 пмоль, Pierce). Условия: Pico-Tag™-колонка (фирма Waters), 38°С, детекция при 254 нм, шкала 0,1 отн. ед. Растворитель А: 6% ацетонитрила+94% 0,14 М ацетата натрия+3,6 мМ триэтиламина (pH 6,4). Растворитель Б: 60%-ный ацетонитрил в воде. Скорость потока 1 мл/мин. Градиент: 0—46% Б, 10 мин, промывка — 100% Б. (С разрешения Waters Assocliates.)

РИС. 8.9. Анализ метолом Pico-Tag™ 1 пмоль аминокислот (фирма Pierce Н). Шкала на 0,005 отн. ед., остальные условия, как на рис. 8.8. (С разрешения Waters Associates.)

Таблица 8.2. Некоторые производные аминокислот для газожидкостной хроматографии

Большинство исследователей для этерификации карбоксильных групп использовали метод Фишера — обработку спиртами с различной концентрацией НСl. Было предложено несколько модификаций, направленных на увеличение выходов продуктов. Обычно используется прямая, одноступенчатая процедура этерификации, но были разработаны и методы переэтерификации [120, 352], в которых метиловые эфиры аминокислот превращались в н-бутиловые, что позволяло избежать осложнений с трудной растворимостью некоторых аминокислот в высших спиртах. Однако позднее исследователи вернулись к первоначальному одностадийному варианту [316].