Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аналитические методы
Количественное определение белка
Введение

Количественное определение белков может быть осуществлено разными методами, основные из них рассмотрены ниже. В качестве стандарта обычно используют бычин сывороточный альбумин (БСА), его следует высушить в вакууме при 60 °С над Р₂О₅ до постоянной массы (удобно делать это в «пистолете» Фишера). 1%-ный раствор БСА при 280 нм в 1-сантиметровой кювете имеет А = 6,6 [362]. На практике при незначительном количестве белка невозможно определить точную массу образца, так как в образце содержатся минеральные примеси и влага [162]. В настоящее время общепринятым методом количественного определения белка является аминокислотный анализ. В 1973 г. были изучены образцы 350 белков и сделано заключение, что анализ, основанный на определении азота в белке, дает в большинстве случаев согласующиеся результаты.

8.18.1.1. Гравиметрический анализ. Этот метод требует значительных количеств материала (порядка миллиграммов).

8.18.1.2. Определение азота. Этот метод также требует большого количества белка, значительных затрат времени и достаточно сложен в экспериментальном отношении. Методика Кьельдаля основана на полном разрушении белка под действием серной кислоты в присутствии катализатора. Азот белка улавливается в форме сульфата аммония и определяется в виде аммиака после перегонки с паром гидролизата, подщелаченного добавлением концентрированной NaOH. Аммиак обычно анализируется обратным титрованием после поглощения в кислотных ловушках, хотя возможны и другие методы, такие, например, как колориметрия или применение электродов, чувствительных к аммиаку [72]. Разработана система, объединяющая прибор для определения аммиака по Кьельдалю с программируемым устройством для титрования (фирма Buchi Lab. Techniues Ltd.). Метод все еще широко используется в пищевой и пивоваренной промышленностях, но в белковых лабораториях он вытеснен аминокислотными анализаторами, обеспечивающими в 100 раз большую чувствительность определения не только аммиака, но и одновременно аминокислотного состава [9, 39].

8.18.1.3. Аминокислотный анализ. Образец белка подвергается исчерпывающему гидролизу, и путем исследования гидролизата определяется аминокислотный состав. Каждая аминокислота может быть легко идентифицирована, если ее количество составляет 5—10 нмоль, а во многих специализированных лабораториях проводится анализ на уровне 50—100 пмоль аминокислоты.

8.18.1.4. Колориметрические методы. Многие из этих методов достаточно просты, по не все могут быть применены к данному конкретному белку. Ошибки в результатах чаще всего обусловлены тем, что исследуемый белок резко отличается по своей природе от белка-стандарта (обычно в качестве белка-стандарта применяется БСА).

1. Биуретовый метод основан па специфической реакции пептидной связи с ионами меди в щелочной среде; методика проста в экспериментальном отношении. Метод ограничен низкой чувствительностью (предел обнаружения белка 300 мкг/мл). Предложено много вариантов реагента с целью увеличения интенсивности окраски, стабильности ее и исключения наложения фона, вносимого соединениями с сульфгидрильными группами (такими, как дитиотреит).

2. Наиболее широкое применение нашел метод Лоури [225]. Возникающая окраска в основном определяется реакцией фенольного реагента (Фолина — Чикольте) с остатками Туг, но определенный вклад дают некоторые другие аминокислоты — Trp, His и Cys, а также пептидные связи. Зависимость интенсивности окраски от количества белка-стандарта не линейна. Определению мешают детергенты, используемые для солюбилизации белков. Предложено много различных модификаций метода.

3. Неспецифическое связывание красителя. Ряд красителей был использован для определения белка по окраске, возникающей в результате простой адсорбции. Некоторые из них дают воспроизводимые результаты (в данных условиях) и достаточно высокую чувствительность, по степень связывания красителя зависит от индивидуальных свойств белка. Кроме того, зависимость степени сорбции от концентрации белка не линейна и у разных белков угол наклона кривой сильно различается.

Несколько примеров. Белок из ткани листьев определен с помощью реактивов цианин G и нафталиновый темно-голубой [40]. Сульфобромофталеин был использован для реакции с белком в кислых условиях; образовавшийся осадок комплекса белок — краситель отделяли центрифугированием и затем вновь растворяли в щелочи и измеряли оптическую плотность при 580 нм [34, 248]. Специфический метод определения коллагена (10 мкг—100 мкг) основан на реакции с красителем Sirius Supra red F3BA |192]. Очень широкое применение нашел кумасси бриллиантовый голубой [38, 336, 350].

Сравнительное изучение содержания белка в образцах из культуры клеток и субклеточных фракций было проведено с использованием методов Лоури и Бредфорда |61|. Метод Лоури дал завышенные результаты, но соотношение величин, полученных двумя методами, было постоянным (среднее значение 1,58±0,09). Рекомендован метод Бредфорда из-за его большей скорости.

Ни один из колориметрических методов не может гарантировать получение корректных результатов со всеми белками, сказывается индивидуальная природа каждого белка и в некоторых случаях наличие загрязнений — детергентов, липидов и т. д., внесенных в процессе его выделения. Так, было показано, что реакция белков с гомобифункциональными сшивающими агентами вызывает падение интенсивности окраски с кумасси или комплексом серебра [217].

Несколько методов, рассматриваемых ниже, наиболее удовлетворяют современным требованиям.

8.18.1.5. Спектрофотометрические методы. Спектрофотометрические методы определения белков имеют ряд преимуществ по сравнению с другими методами и могут быть рекомендованы во многих случаях. Они просты, быстры и нe вызывают структурных разрушений в исследуемом материале. Один из наиболее ранних прочно утвердившийся метод Варбурга и Христиана [388] основан на определении соотношения величин поглощения при 280 и 260 нм и позволяет определять белок в присутствии нуклеиновых кислот. В нескольких методах, предложенных позднее, для измерений используются другие длины волн.

8.18.1.6. Флуорометрические методы. Очень перспективен как высокочувствительный метод анализа флуорометрический метод естественно при условии, что в белок или полипептид можно ввести флуорогенную метку. Этoт метод на конкретных примерах обсуждался в разд. 8.16.3.