Практическая химия белка - А. Дарбре 1989
Аналитические методы
Количественное определение белка
Метод атомно-абсорбционной спектрофотометрии
Метод позволяет определять белки в окрашенных или опалесцирующих растворах [92].
Реагент. 10 мл 0,20 М CuSO4 добавляют к 590 мл 0,167 М NaOH, содержащего 2 г тетрагидрата Nа2К-тартрата. Ионообменная смола AG2-X8.
Таблица 8.3. Определение количества белка по сравнению оптических плотностей при 280 и 260 им
|
A280/260 |
Нуклеиновая кислота, % |
F |
|
1,75 |
0,0 |
1,116 |
|
1,52 |
0,5 |
1,054 |
|
1,36 |
1,0 |
0,994 |
|
1,16 |
2,0 |
0,899 |
|
1,03 |
3,0 |
0,814 |
|
0,939 |
4,0 |
0,743 |
|
0,874 |
5,0 |
0,682 |
|
0,822 |
6,0 |
0,632 |
|
0,784 |
7,0 |
0,585 |
|
0,753 |
8,0 |
0,545 |
|
0,730 |
9,0 |
0,508 |
|
0,705 |
10,0 |
0,478 |
|
0,645 |
14,0 |
0,377 |
|
0,595 |
20,0 |
0,278 |
Атомно-абсорбционный спектрофотометр Varian-Techtron, модель 1000 с воздушно-ацетиленовым пламенем.
Методика. Приливают 1 мл Cu-реагента к 1 мл раствора белка (0,05—1,0 мг/мл). Смешивают. Через 2—5 мин добавляют 250 мг смолы и периодически встряхивают в течение 5 мин. После отстаивания смолы отбирают 1 мл супернатанта и добавляют к 3 мл дистиллированной воды. Определяют содержание меди на атомно-абсорбционном спектрофотометре при 324,8 нм. Готовят контрольный раствор реагентов и строят градуировочный график для БСА (0,05—1,0 мг/мл). Для уменьшения приборных шумов и предохранения прибора от блокировки в промежутках между измерениями образцов распыляют 0,5 мл ледяной уксусной кислоты. Присутствие хлорофилла, гема, рутения и других кофакторов не мешает определению. Метод привлекается, если неприменимы другие методы. Раствор белка должен содержать <0,4 М солей или аминокислот. Нерастворимые белки могут быть переведены в раствор с помощью 1% (масс./об.) ДСН.