Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аналитические методы
Методы окрашивания белков в гелях

Впервые окрашивание комплексами серебра разделенных в электрофоретических гелях белков было применено в 1972 г. [197], но потенциальные возможности этого метода были открыты позднее [359]. Методы окрашивания белков комплексами серебра в 100—200 раз более чувствительны, чем основанные на применении кумасси бриллиантового голубого. Из шести предложенных методик с этим реагентом наилучшие характеризовались пределом обнаружения 0,5 нг белка/мм² поверхности ПААГ [282]. Чувствительность окрашивания комплексами серебра несколько варьирует в зависимости от свойств и природы белка, как показано в сравнительном исследовании четырех различных методик применительно к белкам секрета околоушной железы человека, причем выбор оптимального варианта окрашивания во многом определяет корректность интерпретации результатов [115]. Электрофореграммы, окрашенные кумасси и комплексами серебра, часто отличаются друг от друга, а некоторые белки, как, например калмодулин и тропонин С, обнаруживаются с помощью кумасси, по не проявляются комплексами серебра. Было найдено, что такого рода белки требуют для окрашивания серебром предварительной обработки глутаровым альдегидом, а соответствующая процедура отмывки электрофореграмм должна проводиться под строгим контролем во избежание потерь растворимых белков [328]. Основные белки менее чувствительны к окрашиванию комплексами серебра, чем нейтральные, и для них предложены методы двойного проявления — кумасси и солями серебра [176].

С помощью комплексов серебра удалось обнаружить пептиды в ДСН — ПААГ, полученные из нанограммовых количеств белка [222]. В работе сделан вывод, что метод более быстр, дешев и безопасен, чем радиоактивное мечение и приготовление авторадиограмм или флуореграмм. Были использованы коммерческие наборы реагентов фирмы Upjohn Diagnostics для гелей толщиной 1,5 мм [324] и рекомендован для окрашивания более тонких гелей по методике, описанной в работе [408] (набор фирмы Bio-Rad).

Механизм взаимодействия комплексов серебра с белком включает участие в нем фосфатных [326], сульфгидрильных и карбоксильных групп аминокислот [286]. Чувствительность обнаружения белков реагентом повышалась после предварительной обработки их глутаровым альдегидом [281] или формальдегидом [408], а также в случае предварительного восстановления дитиотреитом [269]. В работе [99] сделан вывод, что усиление чувствительности метода происходит только при обработке глутаровым альдегидом (по не формальдегидом) и что интенсивность окраски линейно коррелирует с числом остатков лизина в белке.

Первоначальный вариант метода [252, 359] был модифицирован многими исследователями с целью сделать его более простым и дешевым [175, 253—255, 269, 281, 305, 324, 408]. См. критический обзор [305].

Окрашивание комплексами серебра — первый надежный метод обнаружения гистонов в гелях, содержащих тритон, кислоту и мочевину, с близкой к линейной зависимостью интенсивности окраски от количества белка при его содержании 0—50 иг [259].

Было показано, что помещение ПААГ-электрофореграммы последовательно в гипер- и гипотонический растворы дает возможность обнаруживать с помощью комплексов серебра 10 фг белка [285]. В то же время в исходном варианте процедура окрашивания солями серебра многостадийна, трудоемка, включает много ручных операций. Неполное удаление непрореагировавших комплексов серебра может привести к образованию сильноокрашенного фона. Продолжительная процедура отмывки электрофореграмм в потоке жидкости позволяет избежать этих осложнений и получить, как было показано па мышечном белке, линейную зависимость в диапазоне 2—70 нг образца в полосе геля [126]. Предложена новая техника микроволновой сушки ПААГ [124], позволяющая осуществить этот процесс за 3,5 мин (вместо обычных 35—45 мин) при толщине геля 0,75 мм и за 1 ч при толщине в 3 мм (аппарат для сушки Bio-Rad делает это за 4—5 ч).