Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аналитические методы
Методы окрашивания белков в гелях
Окрашивание белков комплексами серебра

Внимание! Аммиачные комплексы серебра взрывоопасны и не подлежат хранению. Отработанные растворы комплексов надо обрабатывать НСl для разрушения и разбавлять водой перед удалением.

Для регенерации серебра добавляют насыщенный раствор NaCl, жидкость отделяют путем фильтрования и отбрасывают; собирают осадок AgCl [408].

После окрашивания серебром можно осуществлять непрерывную регистрацию результатов с помощью фотографирования на поляроидную пленку (3X5) или негативную пленку (впоследствии с нее печатают фотографии). Описан метод с использованием пленки прямого копирования (Kodak X-Omat) при УФ-освещении в течение 1—1,5 с с последующей обработкой проявителем и закрепителем фирмы Kodak. Процедура неприменима к образцам, окрашенным кумасси [125].

8.19.2.1. Фотопроявление белков на ПААГ.

Методика A [253]. Для визуального обнаружения белка необходимо всего <50 мин.

1. После электрофореза фиксируют белок в течение 10 мин в растворе, содержащем 50% метанола и 12% уксусной кислоты.

2. Промывают гель дважды смесью 10%-ный этанол — 5%-ная уксусная кислота.

3. Вымачивают гель в 0,5%-ном растворе ферро(II)цианида калия в течение 5 мин при легком встряхивании.

4. Сливают раствор и промывают гель трижды водой (20 с на каждую промывку).

5. Добавляют раствор, содержащий 0,2 г нитрата серебра, 0,2 г нитрата аммония, 0,5 мл 37%-ного формальдегида (фирма Fischer Scientific) и 0,06 мг бензотриазола в 100 мл воды.

6. Освещают гель в течение 20 мин в блоке флуоресцентной лампой 160 Вт, модель Т-12 (фирма Aristo Grid Products) с интенсивностью эмиссии, эквивалентной эмиссии вольфрамового источника света мощностью 500 Вт.

7. Сливают раствор нитрата серебра, и без промывки геля добавляют 200 мл 3%-ного раствора карбоната натрия, содержащего 37% формальдегида и 0,6 мг бензотриазола/л. Продолжают освещение при легком встряхивании. Через 1 мин образуется коричневый осадок и раствор карбоната натрия заменяют на свежий. Процесс заканчивают при достижении необходимой интенсивности окраски.

8. Окрашивание может быть прервано в любую минуту удалением раствора карбоната натрия и вымачиванием геля (5 мин) в 1%-ной уксусной кислоте.

9. Перед хранением гель промывают водой.

Методика Б [256]. Методика позволяет обнаруживать белки и нуклеиновые кислоты в течение 10 мин.

1. Фиксируют гель выдерживанием 5 мин в смеси метанол — уксусная кислота — вода (100:20:80), содержащей 4 г лимонной кислоты и 0,4 г NaCl.

2. Обмывают гель 200 мл деионизованной воды для удаления NaCl.

3. Помещают гель в 200 мл смеси метанол — уксусная кислота — вода (100:20:80), содержащей 4 г нитрата серебра, и освещают, как описано в методике А.

Делают серию фотографий в процессе проявления (для количественного анализа каждые 10 мин).

4. Останавливают окрашивание путем помещения геля в темноту. Чувствительность 0,5 нг белка. ДНК дает негативное окрашивание.

8.19.2.2. Полиакриламидные гели.

Методика [242].

Реагенты для окрашивания солями серебра. Раствор комплекса. Смешивают (1:5) 30%-ный раствор метиламина (продажный) с раствором NaOH (0,36%, масс./об.) и добавляют ~10 мл этого раствора к 4 мл 20%-ного (масс./об.) AgNO₃до образования коричневого осадка и просветления раствора. Доводят общий объем до 100 мл водой. Надо соблюдать меры предосторожности; см. разд. 8.19.2.

Проявитель. Добавляют 15 мл раствора, содержащего 1 % (масс./об.) лимонной кислоты и 1,5 мл 40%-ного (продажного) формальдегида к 3 л воды.

Реагенты для обесцвечивания.

A. Растворяют 11,1 г NaCl и 11,1 г CuSO₄ в 285 мл воды и прибавляют 25%-ный раствор аммиака до выпадения осадка и просветления темно-голубого раствора (конечный объем ∼300 мл).

Б. Растворяют 44 г тиосульфата натрия (пентагидрат) в 85 мл воды (конечный объем ∼100 мл).

B. Осветляющий реагент фирмы Kodak: 20 г в 800 мл воды.

Методика окрашивания.

1. Вымачивают ПААГ (0,8—3,0 мм толщиной) после электрофореза в течение ночи в растворе 50%-ный метанол+10%-ная уксусная кислота (100мл).

2. Промывают при 60 °С в течение 10 и 20 мин, сменяя несколько раз воду (200 мл).

3. Инкубируют 30 мин при 60 °С в 0,1%-ном (масс./об.) растворе формальдегида (200 мл), приготовленного добавлением 2,5 мл 40%-ного формальдегида к 1 л воды.

4. Охлаждают до комнатной температуры 10 мин в воде (200 мл).

5. Встряхивают 10 мин при комнатной температуре в растворе комплекса серебра (200 мл).

6. Сливают раствор комплекса и быстро ополаскивают гель двумя объемами воды и проявителя (каждый раз по 100 мл).

7. Выдерживают гель в течение 30 мин в проявителе, сменяя раствор каждые 5 мин, до почернения фона в результате реакции «серебряного зеркала». Полосы белка постепенно (5—25 мин) становятся интенсивно окрашенными.

8. Промывают гель 10 и 20 мин двумя сменами холодной воды и вымачивают ночь в свежей порции воды.

Методика обесцвечивания. Смешивают реагенты А и Б в пропорции 3 : 1 и разбавляют равным объемом воды. Инкубируют гель в этом растворе (100 мл) 1—4 мин, пока фон не пожелтеет. Быстро споласкивают водой и погружают на 30 мин в реагент В (100 мл). Промывают тремя объемами воды (выдерживая соответственно 10, 20 и 30 мин).

Замечание. В основу метода положены ранние работы [241, 244]. Метод дает высокую чувствительность (0,01 нг БСА/мм²) благодаря использованию низкой концентрации формальдегида и процедуре интенсивного окрашивания с последующим обесцвечиванием. Двумерным электрофорезом в сочетании с этим методом было разделено и обнаружено более 200 пептидов из 30 мкл мочи и более 150 — из одного отпечатка пальца. См. также работу [243], где применялось окрашивание комплексами серебра белков из слюны человека.

8.19.2.3. Крупнопористые ПААГ [295, 244]. Крупнопористые гели используются для электрофоретического фракционирования макромолекул с молекулярными массами > 106. Агарозные гели становятся темными при обработке комплексами серебра, поэтому описанная выше методика окрашивания не может быть к ним применена [35]. Ниже приводится методика окрашивания крупнопористых гелей, приготовленных на основе 2,55%-ного полиакриламида с 2,75% сшивок с метиленбисакриламидом.

Методика.

1. После электрофоретического разделения белков гель вымачивают в течение 1 ч в смеси 37%-ный формальдегид (фирма Fluka) — этанол — вода (15:27:63) и затем оставляют на ночь в смеси другой концентрации указанных компонент (1:25:75).

2. Встряхивают гель при 60 °С в растворе метанол — уксусная кислота — вода (5:7:88) по крайней мере 4 ч со сменой раствора каждые 20— 30 мин.

3. Встряхивают гель при 60 °С 15 мин со свежим раствором 4%-ного масс./об.) параформальдегида (фирма Merck) в 1,43% -ном (масс./об.) какодилате натрия (фирма Fluka), pH 7,3.

4. Промывают гель при 60 °С дистиллированной водой не менее 3 ч, сменяя воду каждые 20—30 мин.

5. Помещают гель в раствор комплекса серебра (разд. 8.19.2.2) на 10 мин при комнатной температуре.

6. Ополаскивают водой 2—3 мин.

7. Проявляют свежеприготовленным водным раствором лимонной кислоты (0,005%, масс./об.; фирма Merck) и формальдегида (0,019, масс./об.; фирма Merck), постоянно меняя раствор, до появления темных полос белка.

8. Прекращают окрашивание добавлением метанола (5%).

8.19.2.4. Агарозные гели после изоэлектрофокусирования. Метод окрашивания комплексами серебра в течение 10 мин в 20 раз более чувствителен, чем окрашивание кумасси R250, и может применяться после окрашивания красителем [211].

Фиксация и высушивание. После изоэлектрофокусирования белки в гелях фиксируют погружением на 10 мин в раствор 10%-ная трихлоруксусная кислота—1%-ная сульфосалициловая кислота. Промывают 10 мин 95%-ным этанолом. Сушат в потоке теплого воздуха.

Авторадиография. Для изотопов с низком энергией используют пленку Ultrofilm [³Н] LKB 2208-190 с обработкой ее проявителем LX24 и закрепителем AL4 для рентгеновской пленки Kodak.

Окрашивание кумасси. Погружают гель на 5 мин в раствор, содержащий 35% этанола, 10% уксусной кислоты и 0,6% кумасси R250. Обесцвечивают 10 мин смесью 35%-ный этанол — 10%-ная уксусная кислота.

Окрашивание комплексами серебра.

1. После фиксации гель помещают на 5 мин в раствор, содержащий 50% метанола, 12% трихлороуксуснон кислоты, 2% СuСl₂ и 1% ZnCl₂ и высушивают.

2. Погружают гель в смесь (1 :2) 0,01%-ного КМnО₄ и гистологического красителя Харриса гематоксилина (фирма Chroma 2Е 0565). Состав красителя: 10 мл этанола+1 г гематоксилина + 20 г калий-аммонийфосфата + 0,5 г желтого оксида ртути.

3. Ополаскивают гель в дистиллированной воде (несколько секунд), при этом оранжевая окраска бледнеет и переходит в розово-лиловую.

4. Приготовление растворов. А. 8 г безводного карбоната натрия в 100 мл дистиллированной воды (готовится ежедневно). Б. Растворяют в 80 мл воды (в указанном порядке) 0,28 г нитрата аммония, 0,2 г нитрата серебра, 1 г кремневольфрамовой кислоты (SiО₂∙12WО₃∙26H₂О) и 0,73 мл 35%-ного формальдегида. Доводят объем до 100 мл (можно хранить в течение нескольких месяцев при комнатной температуре). Непосредственно перед использованием смешивают равные объемы растворов А и Б и погружают в эту смесь гель. В течение 1—3 мин полосы белка становятся красно-коричневыми, а затем черными.

5. Останавливают реакцию промыванием геля в дистиллированной воде в течение нескольких секунд.

Чувствительность метода 0,045 мкг белка в полосе геля. См. также в работе [380] окрашивание белков комплексами серебра в агарозных гелях.

8.19.2.5. Полиакриламидные и агарозные гели после обработки глутаровым альдегидом. Метод основан на одностадийном восстановлении серебра после обработки белка глутаровым альдегидом. Стадии промывки в описании опущены.

Реагенты. Раствор глутарового альдегида (фирма Merk-Schuchardt). Аммиачный комплекс серебра (0,2%-ный раствор, масс./об.): смешивают раствор NaOH (0,36 г в 21 мл воды), 1,4 мл NH₄OH (28%, масс./об.) и 1 мл нитрата серебра (20%, масс./об.) и доводят общий объем до 100 мл водой. Надо соблюдать меры предосторожности; см. разд. 8.19.2.

Полиакриламидные гели. После электрофореза фиксируют белок 30 мин в растворе 45%-ный метанол — 10%-ная уксусная кислота. Промывают водой для удаления органических растворителей. Помещают гель в 200 мл (1%, масс./об.) раствора глутарового альдегида и выдерживают при интенсивном размешивании 15 ч при комнатной температуре.

Важно строгое соблюдение концентрации глутарового альдегида, 1%-ный раствор пригоден для гелей размером 120X140 мм и 0,5%-ный — для гелей 30x45 мм при толщине 0,75—1,5 мм.

Переносят гель в раствор комплекса серебра на 30 мин. Интенсивное перемешивание предупреждает осаждение серебра па геле. Окраска фона может быть снята селективно в течение нескольких минут обработкой 10%-ной уксусной кислотой.

Промывают гель водой (или забуференным физиологическим раствором с pH 7,2, если использовалась уксусная кислота). Фотографируют. Хранят пластинки геля в пластиковых емкостях. Чувствительность 0,03 нг/мм² для БСА и 0,5 нг/мм² для овальбумина, т. е. в 100 раз выше, чем при применении кумасси.

Агарозные гели. После иммуноэлектрофореза агарозный гель увлажняют дистиллированной водой или физиологическим раствором, промокают фильтровальной бумагой и высушивают в течение 15 мин. Переносят в 100 мл раствора комплекса серебра на 5—40 мин. Окраску фона снимают, как описано выше. На всех стадиях используют интенсивное перемешивание.

8.19.2.6. Окрашивание комплексом серебра с последующим тонированием [23]. Интенсивность окрашенных полос белка может быть увеличена в 7—10 раз с помощью описываемой ниже обработки. Оценка методом денситометрии показала, что линейность зависимости интенсивности окраски от концентрации белка сохраняется в диапазоне 0,05—1,7 пмоль/мм².

Реагенты.

A. 5%-ный (масс./об.) раствор хлорида железа(II).

Б. 3%-ная (масс./об.) щавелевая кислота.

B. 3,5%-ный (масс./об.) раствор ферро(III)цианида калия.

Эти растворы можно хранить в течение нескольких месяцев при комнатной температуре.

Тонирующая ванна. Смешивают по 10 мл каждого из реагентов А, Б и В и добавляют 70 мл воды. Готовят непосредственно перед употреблением. Раствор должен быть коричневым, при возникновении зелено-голубой окраски не пригоден к употреблению.

Методика. Полиакриламидные гели окрашивают комплексом серебра [269], промывают проточной водой (под краном) по крайней мере 30 мин и затем помещают на 0,5—3 мин в тонирующий раствор. Полосы белков при этом становятся голубыми. После промывки в течение 10 мин водой (под краном) окраску стабилизируют вымачиванием 10 мин в смеси 20%-ный метанол — 5%-ная уксусная кислота; хранят гели в запаянных полиэтиленовых пакетах. Количественная оценка проводится при окрашивании солями серебра денситометрически при 550 нм и после тонирования спектрофотометрически при 660 нм на спектрофотометре Gilford Model 250. Фотографируют гели на пленку Panatomic film (фирма Kodak).

8.19.2.7. Двойное окрашивание кумасси и комплексом серебра [176]. Предварительная обработка кумасси с одновременной фиксацией формальдегидом повышает интенсивность окрашивания и облегчает идентификацию полос на геле.

Фиксация и обработка кумасси.

1. ПААГ после электрофореза погружают на 1 ч в раствор формальдегид — уксусная кислота — этанол — вода (5:10:25:60), содержащий кумасси R250 (0,05%, масс.об.), а затем на 3 ч или на ночь в раствор из тех же компонентов в соотношении 0,5:10:25:64, содержащий 0,05%-ный кумасси R250.

2. Сливают красящий раствор, промывают гель смесью уксусная кислота — изопропанол — вода (10:25:65), а затем смесью из тех же растворителей в соотношении 10:10:80 до осветления фона.

Окрашивание солями серебра (модифицированная методика) [252].

1. Промывают гель после фиксации 10%-ным водным раствором этанола для удаления уксусной кислоты.

2. Промывают в течение 30 мин смесью 4%-ный параформальдегід — 1,43%-ный (масс., об.) какодилат натрия (подкисление до pH 7,6 с помощью НСl).

3. Промывают 10%-ным этанолом 4 раза по 5 мин.

4. Выдерживают 30 мин в растворе нитрат меди — нитрат серебра (растворяют 3,5 г нитрата серебра в 100 мл воды и прибавляют 1,5 мл 0,5%-ного (масс./об.) раствора меди, содержащего 4 мл пиридина и 8 мл абсолютного этанола).

5. Промывают 5 мин в свежеприготовленном растворе комплекса: смешивают 30 мл 19,4%-ного (масс./об.) раствора нитрата серебра и 22,2 мл щелочно-аммиачного водно-этанольного раствора (100 мл 0,36%-ного водного раствора NaOH + 45 мл концентрированного аммиака+ 55 мл 20%-ного этанола).

6. Обрабатывают дважды по 1 мин раствором восстановителя: 2,5 мл 10%-ного формальдегида (готовят разбавлением продажного формальдегида водой, 1 : 10)+6 мл 1%-ной лимонной кислоты + 100 мл этанола; доводят общий объем до 1 л водой. Затем ополаскивают несколько раз вторым раствором восстановителя; 5 мл 10%-ного формальдегида+5 мл 1%-ной лимонной кислоты + 100 мл этанола; доводят общий объем до 1 л водой; обработку проводят до появления коричневых и черных полос белка на электрофореграмме.

7. Останавливают проявление путем погружения геля в 1%-ную уксусную кислоту. В этом растворе гель можно хранить в течение по крайней мере 2 мес; можно также высушить пластинки в вакууме при 100 °С на фильтровальной бумаге. Чувствительность 0,02—0,2 нг/мм² для нейтральных белков и —1,0 нг/мм² для основных белков.