Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Определение состава белковых олигомеров. Получение мономеров и полипептидных цепей
Получение мономеров с целью секвенирования
Обессоливание

Обычно мономер или полипептидные цепи обессоливают с помощью диализа или гель-фильтрации. Значение операции обессоливания не следует недооценивать. Иногда, прежде чем вести диализ против воды, образец целесообразно диализовать против разбавленных электролитов или буферных растворов. В этом случае образец сохранит растворимость в воде после исчерпывающего обессоливания. Для диализа в небольшом объеме выпускаются специальные ячейки.

Гель-фильтрация на заранее подготовленных колонках (разд. 1.2.2.1) — более быстрый способ обессоливания. Элюент и параметры матрицы выбирают в соответствии с растворимостью и молекулярной массой исследуемого белка. Слаборастворимые гидрофобные белки растворяют в 98%-ной муравьиной кислоте, которую перед нанесением образца на колонку разбавляют до 75%-ной концентрации (разд. 1.3.2.1). Белки с молекулярной массой 5000—30 000 обессоливают на сефадексе G-25, более высокомолекулярные белки — на сефадексе G-50. Объем образца не должен превышать 1/3—1/4 объема колонки. Фирма Pharmacia выпускает колонки с сефадексом G-25, рассчитанные на быстрое (в течение 5 мин) обессоливание образцов объемом 2,5 мл.

1.6.5.1. Проведение обессоливания [83]. Небольшие пептиды обессоливают на колонках с биогелем Р-2 в 1 М уксусной кислоте или с сефадексом G-10 в 1 М NH₄OH, а затем высушивают лиофильно.

Крупные пептиды и белки трижды диализуют в течение 12 ч против 0,15 М NaCl, содержащего 0,1% ДСН, а затем трижды против 0,02% ДСН. Если белок был выделен методом электрофореза в ПААГ — ДСН, элюат центрифугируют при 20 000 об./мин в течение 20 мин для удаления частиц акриламидного геля. Примеси красителя кумасси не мешают секвенированию. Однако следует помнить, что равновесное распределение ДСН через диализную мембрану — процесс медленный и может потребовать нескольких дней. Таким образом, окончательная концентрация ДСН в образце зависит от продолжительности диализа.

Для обессоливания образцов можно использовать электродиализ (разд. 17.3.1).