Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Методы твердофазного анализа аминокислотной последовательности
Методы присоединения
Присоединение по лактону гомосерина

Для этой конденсации используют ТЭТА-полистирол [24, 33], а также стекла (АПС или ß-АПС).

12.4.3.1. Преимущества, ограничения и методика присоединения.

Преимущества.

1. Для пептидов, содержащих гомосерин, выходы конденсации составляют 80—90%.

2. Можно определить полную последовательность таких пептидов, включая С-концевой остаток.

3. Кроме отщепленных аминокислот в растворе содержится мало других примесей при условии, что носитель хранили в ампулах под азотом при —20 °С и тщательно промывали непосредственно перед использованием.

4. Этим методом в продуктах бромоцианового гидролиза можно отделить пептиды, содержащие гомосерин, от С-концевого пептида, в котором отсутствует гомосерин.

Ограничения.

1. ТЭТА-полистирол довольно неустойчив; его нельзя хранить долго.

2. Следует тщательно промывать ТЭТА-полистирол перед использованием.

3. При работе с лизилсодержащими пептидами этот носитель менее эффективен, чем аминополистирол и аминопропилстекло, поскольку наблюдается увеличение фона примесей. Сообщалось, что обработка пептидилполимера N-ацетилимидазолом сразу же после конденсации пептида с полимером уменьшает число ложных нингидринположительных пятен при идентификации ФТГ-аминокислот.

Методика присоединения. Емкость носителя 1 нмоль/мг смолы. 50 мг ТЭТА-смолы или 100 мг 3-аминопропилстекла промывают (ДМФА, 4 раза по 2 мл); в случае ТЭТА-смолы дополнительно промывают триэтиламином (2 раза по 1 мл). В заключение промывают метанолом (2 раза по 2 мл) и ДМФА (2 раза по 1 мл).

Лaктонизация пептида. Пептид сушат в вакууме над пентоксидом фосфора. Добавляют перегнанную безводную ТФУ (50—100 мкл на 5—20 нмоль пептида; 0,5 мл — на 50—200 нмоль) и оставляют на 1 ч при комнатной температуре под азотом. Продукт сушат на роторном испарителе или з концентраторе (Speed Vac Concentrator, фирма Savant), затем в вакууме над едким кали. Повторяют обработку ТФУ в течение 15 мин.

Присоединение. Лактон пептида растворяют в смеси 175 мкл ДМФА + 25 мкл триэтиламина; если пептид не растворяется, добавляют триэтиламин до концентрации 20%. Контролируют растворимость, отбирая пробы по 2—5 мкл. Добавляют под азотом раствор пептида к предварительно отмытой ТЕТА-смоле (или к 20 мг аминопропилстекла). Пробирку, содержащую пептид, ополаскивают ДМФА (2 раза по 100 мкл) и добавляют промывки к реакционной массе. Приливают 50 мкл триэтиламина, озвучивают ультразвуком, выдерживают, мягко перемешивая, под азотом 90 мин при 45 °С, промывают ДМ ФА, метанолом и центрифугируют. Жидкость над осадком контролируют на содержание пептида.

Насыщение. К носителю добавляют 200 мкл раствора ФИТЦ в ацетонитриле (1:5, по об.) и 200 мкл буфера № 1 (разд. 12.2.6). Перемешивают под азотом 30 мин при 30 °С. Центрифугируют и промывают смолу ДМФА (2 мл) и метанолом (2 раза по 2 мл). Сушат смолу в вакууме.