Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Анализ фенилтиогидантоинов аминокислот
Введение

М. Д. УОТЕРФИЛД, Дж. СКРЕЙК, Н. ТОТТИ (М. D. WATTERFIELD, G. SCRACE, N. TOTTY, Protein Chemistry Laboratory, Imperial Cancer Research Fund, Lincoln’s Inn Fields, London WC2A 3PX, UX)

Отщепление по Эдману при помощи ФИТЦ — наиболее распространенный и надежный метод определения аминокислотной последовательности пептидов и белков. В настоящее время в анализе и больших, и малых пептидов используют ручной и автоматический методы; при этом в большинстве случаев идентификацию отщепленных аминокислот проводят в виде их ФТГ-производных. Анализу последних посвящено множество статей. В этой главе рассматривается пять основных методов анализа ФТГ-производных аминокислот.

Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ), использованный Эдманом и Бэггом и описанный в их классической работе, посвященной автоматическому секвенатору [2], наиболее прост в экспериментальном отношении, не требует дорогого оборудования, но характеризуется невысокой чувствительностью (~1 нмоль). ТСХ удобна как для ручного, так и для автоматического определения последовательности; однако это скорее качественный, чем количественный метод. Как бесспорное достоинство метода надо отметить возможность одновременного анализа нескольких образцов. Метод можно сделать полуколичественным, элюируя ФТГ с хроматографической пластинки, но обычно это не делается. При идентификации ФТГ- Arg и ФТГ-His ТСХ следует дополнять другими методами — ВЭЖХ тех же ФТГ-аминокислот, или аминокислотным анализом свободных аминокислот, полученных при обратном гидролизе ФТГ-аминокислот. Следует проводить обратный гидролиз при анализе только коротких пептидов и высокоэффективном определении последовательности аминокислот средних пептидов на секвенаторе с использованием наномольных количеств образца. Для анализа ФТГ-производных аминокислот с середины 60-х годов стала использоваться газожидкостная хроматография (ГЖХ). Этим методом можно быстро и количественно определить большинство, но не все ФТГ-производные аминокислот. В неспособности ГЖХ обеспечить однозначную идентификацию ФТГ-производных всех 20 аминокислот заключается главный недостаток метода. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) позволяет быстро разделить и количественно идентифицировать ФТГ-производные всех 20 аминокислот на пикомольном уровне. Отметим еще один метод, используемый лишь в некоторых лабораториях. Это масс-спектрометрия; метод характеризуется наивысшей чувствительностью, но требует сложного оборудования, доступного лишь немногим лабораториям.

При выборе метода анализа надо четко учитывать цену и доступность оборудования, а также реальную чувствительность, необходимую для работы. В настоящее время предпочитают ВЭЖХ, особенно для высокочувствительных определений. В данной главе рассматривается главным образом этот аспект ее применения.