Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Новейшие методы твердофазного и жидкофазного определения аминокислотной последовательности
Автоматический жидкофазный анализ. Усовершенствованные методики
Анализ последовательности аминокислот небольших и гидрофобных пептидов

Общеизвестно, что автоматический анализ таких объектов часто оканчивается неудачно из-за вымывания пептида при экстракции реакционной массы растворителями и остаточными количествами реагентов. Поскольку наибольшие потери происходят при промывании реактора этилацетатом, удаляющем квадрол, было предложено заменить квадрол летучим буфером, удаляемым испарением в вакууме, и тем самым исключить из программы этилацетатную промывку [77]. Для анализа полной аминокислотной последовательности неполярных пептидов требуются дополнительные изменения как в методике, так и в программе отщепления.

Пептиды, содержащие С-концевые остатки Lys или S-аминоэтил цистеина, модифицировали 4-сульфофенилизотиоци анатом для увеличения гидрофильности пептида [16, 52].

Этот реагент присоединяется как к N-копцевой а-аминогруппе, так и к аминогруппам боковых цепей упомянутых аминокислот. При обработке кислотой отщепляется первый остаток, а второй готов к участию в обычной реакции Эдмана; сульфофенилтиокарбамоильная группа, присоединившаяся к боковой цепи С-концевой аминокислоты, остается неотщепленной. Единственный недостаток этой методики заключается, в неполном отщеплении первого остатка, что сильно снижает начальный выход и вносит высокий фон остаточных аминокислот в самом начале анализа. Кроме того, идентификация первой аминокислоты представляет некоторую трудность. Сообщалось, что изомер (3-сульфофенилизотиоцианат) обладает некоторыми преимуществами при проведении этой модификации [30], однако до сих пор мало известно о его использовании. Для увеличения гидрофильности пептида можно амидировать карбоксильные группы боковых цепей 2-амино-1,5-дисульфонатом [36]. Однако необходимая для этого активация карбоксилов может привести к блокированию N-концевой аминогруппы и вызвать внутреннюю циклизацию остатков Asp.

Для снижения потерь пептида с экстракциями предложен и другой подход. После проведения стадии карбамоилирования квадрол не экстрагируют растворителями, а оставляют в реакторе для получения гидрофильной пленки, удерживающей пептид [25]. Однако сохранение квадрола в реакторе невыгодно, ибо в результате добавления его в каждом цикле после проведения нескольких циклов в реакторе накапливается большое количество солей.

Предполагалось, что «якорем», удерживающим пептид в реакторе, может служить белок с блокированной N-концевой аминокислотой, не вступающий в реакцию Эдмана. С этой целью использовался парвальбумин [89].

Но этот белок при воздействии кислоты подвергается хаотическому расщеплению; появляются новые последовательности, возрастает уровень фона ФТГ-аминокислот. Удерживание малых или гидрофобных пептидов в реакторе значительно возрастает в присутствии полибрена — синтетического полимера, имеющего положительно заряженные четвертичные атомы азота и инертного в условиях анализа последовательности [59, 100]. Мы использовали его при работе с очень большими пептидами, содержащими много неполярных аминокислот. Для некоторых пептидов получены хорошие результаты; в то же время мы не заметили существенного влияния добавления полибрена при работе с другими большими фрагментами или целыми белками. Более того, при использовании полибрена мы наблюдали снижение начальных выходов (см. также гл. 15).