Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Анализ аминокислотной последовательности на микроуровне с использованием газофазного пептидо-белкового секвенатора
Очистка полипептида для микроанализа
Аппаратура и методика

Для разворачивания полипептидной цепи образец нагревают в течение 5 мин при 80 °С в 0,08 М трис-буфере (pH 6,8), содержащем 2% ДСН, 75 мМ дитиотреит (фирма Calbiochem), Ю% (об./об.) глицерина и 0,05% бромотимолового голубого. После охлаждения до комнатной температуры к образцу добавляют тиогликолят натрия до концентрации 5 ммоль/л и проводят ДСН — ПААГ-электрофорез [10]. По завершении электрофореза гели окрашивают в - течение 15 мин в растворе, содержащем 20% изопропанола, 10% уксусной кислоты и 0,5% кумасси голубого, затем отмывают при 4 °С в растворе, содержащем 25% метанола и 10% уксусной кислоты. Гель с полосой белка, окрашенного кумасси, вырезают бритвенным лезвием, режут на небольшие кубики, которые оставляют на 1 ч набухать в дистиллированной воде для удаления уксусной кислоты и метанола. Избыток жидкости сливают с геля, оставляют частицы геля набухать в течение 2—16 ч при комнатной температуре в 0,5—1,0 мл раствора 0,2 М бикарбоната аммония, содержащего 1% ДСН и 0,1% дитиотреита. Эта обработка нейтрализует остаточную кислотность и повторно насыщает белок ДСН.

Конструкция электрофоретического элюатора-концентратора включает две камеры из оргстекла для загрузки и концентрирования образца, каждая из которых у дна закрыта диализной мембраной; камеры соединены друг с другом электролитическим мостиком. Прибор по конструкции сходен с коммерческой моделью фирмы Isco, за тем исключением, что меньшая камера (концентрирования) расширена у дна для выравнивания ее диаметра с диаметром большей камеры (загрузки). Это конструктивное решение облегчает концентрирование белка через мембрану меньшей камеры, но вместе с тем ухудшает условия концентрирования ДСН, так как площади поверхности мембран, через которые происходит миграция ионов наружу и вовнутрь элюатора, одинаковы.

РИС. 17.6. Выходы ФТГ-производных аминокислот при анализе N-концевой последовательности 5 нмоль, 500 и 70 пмоль ангиотензина II (последовательность Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe). Обработка результатов, как указано в подписи к рис. 17.5.

Частицы геля и уравновешивающий раствор, содержащий 1% ДСН, переносят в загрузочную камеру элюатора. Прибор заполняют 0,05 М бикарбонатом аммония, содержащем 0,1% ДСН и 0,5 мМ тиогликолята натрия. Сосуды для электродов заполняют тем же раствором. Электрофорез проводят в течение 16 ч при напряжении 50 В с рециркуляцией буферного раствора; затем электродный буферный, раствор заменяют раствором 10 мМ бикарбоната аммония, содержащего 0,02% ДСН. Электрофорез продолжают еще 20 ч при напряжении 80 В. При этом элюирующийся белок количественно концентрируется в объеме раствора <100 мкл. Плотную зону кумасси голубого и белка удаляют с диализной мембраны микрошприцем (фирма Hamilton). Затем наносят образец на поверхность стекловолокнистого фильтра секвенатора.