Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Анализ аминокислотной последовательности на микроуровне с использованием газофазного пептидо-белкового секвенатора
Обсуждение
Количество анализируемого образца

Представительный список исследованных образцов приведен в табл. 17.3. В настоящее время минимальное количество материала, необходимое для получения полезной информации о последовательности, составляет 5—10 пмоль (0,05—0,1 мкг) в случае белка среднего размера и 50 пмоль (0,05 мкг) для короткого пептида. Секвенирование сильно гликозилированных белков, таких, как эритропоэтин (60% углеводов), до сих пор не представляло особых проблем, хотя необходимо увеличивать время отщепления аминокислот, стоящих в цепи как до, так и после гликозилированного остатка, для сведения к минимуму содержания остаточных аминокислот, вызванного неполнотой отщепления предыдущих. Аналогичным образом поступают в случае последовательностей, содержащих пролин, сопровождаемый аминокислотными остатками, имеющими объемные боковые цепи (Lys, Arg, Leu в нейропептиде В из Aplysia).

Пожалуй, наиболее важное преимущество ГФ-секвенатора состоит в том, что, он позволяет анализировать следовые количества полипептидов, выделенных электрофорезом в полиакриламидных гелях в присутствии ДСН и элюированных из окрашенных гелей (антиген клеточной стенки меланомы, мембранный фосфопротеин из Aplysia, интерлейкин II или фактор роста Т-клеток).

Таблица 17.3. Пептиды, анализированные на ГФ-секвенаторе

	Отношение числа идентифицированных остатков к общему числу остатков	Количество
Анализируемый образец		пмоль	мкг
Ангиотензин	8/8	500	0,5
Ангиотензин	6/8	50	0,05
Соматостатин	14/14	1400	2,0
В-цепь инсулина	30/30	300	1,0
Нейропептид В из Aplysia	31/34	500	2,0
Динорфин	14/17	20	0,04
Миоглобин	90/153	10 000	165
Миоглобин	22/153	5	0,08
Белок 1 кутикулы личинки дрозофилы^а	55/166	850	15
Белок 3 кутикулы личинки дрозофилы^а	36/96	900	9
Мембранный фосфопротеин (М 22∙10³) из Aplysia ^б	23/200	15	0,3
Фактор роста Т-клеток человека ^б	15/160	25	1,0
a-цепь антигена HLA-DR гистосовместимости человека	49/300	700	23
ß-цепь антигена HLA-DR гистосовместимости человека	39/240	500	13
Эритропоэтин человека ^в	28/150	100	1,6
Антиген поверхности клетки меланомы человека ^в	13/850	60	5,5

^а Очищен электрофокусированием в ПААГ, содержащем мочевину. Элюирован электрофоретически из ДСН — ПААГ, окрашенного кумасси голубым. ^в 60% углеводов по массе.