Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Фрагментация полипептидной цепи ферментативными методами
Приготовление субстрата

Полнота ферментативного гидролиза определяется физическим состоянием субстрата. Так, например, если нативный белок и подвергается протеолизу, то весьма вероятно, что такой гидролиз будет ограниченным. Однако в случае необходимости получения фрагментов белка, обладающих частичной биологической активностью, этот метод вполне применим. Такой подход подробно обсуждается в разделе, посвященном использованию трипсина, пепсина и папаина. В общем случае для обеспечения полноты гидролиза белок денатурируют с обязательным восстановлением дисульфидных связей.

В большинстве случаев достаточно кипячения в течение 5— 10 мин при нейтральном pH или осаждения 5%-ным раствором трихлороуксусной кислоты. Восстановление дисульфидных связей проводят в присутствии денатурирующего агента, например 8 М мочевины или 6 М гуанидин-HCl, а затем алкилируют образующиеся остатки цистеина. Методы восстановления дисульфидных связей и последующего алкилирования рассматриваются в разд. 3.3 и в гл. 2.

При денатурации растворимость белков резко понижается, и, хотя ферментативный гидролиз нерастворимых субстратов особой проблемы не представляет, иногда обработка таких субстратов является сложной задачей. Для успешного ферментативного гидролиза нерастворимого белка полученный осадок следует по возможности перевести в тонкую суспензию. С этой целью белок переводят в раствор при экстремальном значении pH, а затем уже полученный раствор титруют до необходимого pH. Образец белка можно также растворить в 6 М гуанидин-НСl, который затем удаляется путем диализа. Если указанная обработка не дает удовлетворительных результатов, то белок солюбилизируют путем обратимой модификации по остаткам лизина, например с помощью цитраконилирования. В результате белок приобретает дополнительный заряд, что часто приводит к дезагрегации.

Некоторые протеолитические ферменты частично или полностью сохраняют свою активность в денатурирующих условиях, и, следовательно, их можно использовать при низких концентрациях мочевины, гуанидин-HCl или додецилсульфата натрия (ДСН). В ряде случаев для повышения растворимости увеличивают концентрацию буферного раствора или гидролиз ведут при повышенной температуре. Далее приводятся подробные сведения о ферментах, сохраняющих ферментативную активность в денатурирующих условиях или при повышенной температуре. Особое внимание уделяется трипсину, клострипаину, протеазе V8 из S. aureus, химотрипсину, термолизину и папаину.