БІОХІМІЯ - Лабораторний практикум - НАУ 2015
МОДУЛЬ IV
МЕТАБОЛІЗМ ОСНОВНИХ КЛАСІВ БІОМОЛЕКУЛ
Лабораторна робота 12
ДОКАЗИ БУДОВИ ТА ВЛАСТИВОСТЕЙ ЛІПІДІВ
Мета роботи: дослідити розчинність ліпідів, опанувати методи виявлення ліпідів, доведення їх ненасиченості, виділення складових компонентів простих ліпідів.
Основні теоретичні відомості
Ліпіди — біоорганічні молекули, які різняться за своєю будовою, функціями, всі є нерозчинними в полярних розчинниках, наприклад у воді, але розчиняються в неполярних органічних розчинниках (ацетон, хлороформ, діетиловий ефір тощо). Під час змішування жирів із водою утворюються емульсії, стійкість яких залежить від середовища, у якому вони створюються. Наявність у воді речовин-емульгаторів (мила, жовчні кислоти, карбонати тощо) збільшує стійкість емульсій. Утворення емульсій зумовлене тим, що в поверхневий водяний шар, який оточує жирові краплинки, спрямовуються поверхнево-активні частинки жовчних кислот, мила, карбонату, котрі обволікають краплинки жиру і перешкоджають їх злиттю.
Ліпіди переважно є складними ефірами спиртів та вищих жирних кислот (ВЖК). Вищі жирні кислоти містять понад 10 атомів карбону, можуть бути насиченими або мати у своєму складі подвійні зв’язки. Природні ВЖК мають парну кількість атомів карбону, зигзагоподібну конформацію радикала, для ненасичених подвійні зв’язки є метиленрозділеними. Вітамін F є комплексом поліненасичених ВЖК. Арахідонова кислота — поліненасичена ВЖК, з якої в організмі синтезуються тканинні гормони.
Прості ліпіди побудовані лише зі спирту та ВЖК. Складні ліпіди містять ще додаткові компоненти — фосфат, вуглеводи, аміноспирти, амінокислоти тощо. Фосфоліпіди є основними молекулами, з яких побудовані біологічні мембрани. Ліпіди є важливим джерелом енергії, вони нагромаджуються в організмі. Резервними ліпідами є нейтральні ліпіди (тригліцериди (ТГ), триацилгліцероли). Вони побудовані з трьохатомного спирту гліцерину та ВЖК.
Обладнання: штатив із пробірками, піпетки, крапельниці, мірні колби, хімічні стакани, лійки, водяна баня, газовий пальник.
12.1. Розчинність ліпідів і утворення емульсії
Матеріали та реактиви: олія, спирт, бензол, хлороформ, 1 %-й розчин Na2CО3.
Порядок виконання роботи
У чотири пробірки наливають по 0,2—0,3 мл олії, потім у першу додають 5 мл води, у другу — 5 мл спирту, у третю — 5 мл бензолу, у четверту — 5 мл хлороформу. Уміст усіх пробірок енергійно струшують. У першій пробірці олія та вода швидко діляться на два шари, у другій пробірці утворюється каламутний розчин унаслідок недостатньої розчинності олії в спирті, у третій і четвертій — розчини прозорі.
У дві пробірки вносять по кілька крапель олії. В одну з них додають 2 мл води, у другу — 2 мл розчину Na2CО3. уміст пробірок інтенсивно струшують і спостерігають утворення емульсії. Відзначають різну стійкість емульсій у двох пробірках.
12.2. Виявлення ненасиченості ліпідів
Матеріали та реактиви: розчин вершкового масла в хлороформі (0,2 — 0,25 г масла в 1 мл хлороформу), розчин олії в хлороформі (така сама кількість олії в 1 мл хлороформу), насичена бромна вода (5 г брому з 100 мл води в колбі з притертою пробкою струшують під витяжкою, іноді відкриваючи пробку для вивільнення парів брому).
Порядок виконання роботи
Жири рослинного походження містять більшу кількість залишків ненасичених жирних кислот, ніж жири тваринного походження. Різний ступінь ненасиченості ліпідів можна виявити на прикладі насичення бромом вершкового масла або олії.
В одну пробірку вносять 1 мл розчину олії в хлороформі, у другу — 1 мл розчину вершкового масла в хлороформі. Потім у кожну пробірку краплинами додають бромну воду до припинення знебарвлення. Фіксують кількість бромної води, унесеної в кожну пробірку.
12.3. Омилення жиру, утворення нерозчинного мила
та виділення вільних жирних кислот
Матеріали та реактиви: олія, 50 %-й спиртовий розчин KOH або NaOH, 5 %-й розчин СаС12, концентрована НС1.
Порядок виконання роботи
Жири під дією лугу гідролізуються, утворюючи мила та гліцерол:
Трисреарин Гліцерол Стеарат натрію
У колбу з 1 мл олії додають 20 мл спиртового розчину KOH (NaOH), перемішують і кип’ятять на водяній бані зі зворотним холодильником протягом 1 год. Після омилення розчин розводять водою до об’єму 20 мл. Одержаний розчин мила використовують для наступних реакцій.
У пробірку з 2 мл розчину мила додають 1 мл розчину СаС12.
Під час внесення до розчину калієвого мила розчину солей кальцію утворюються нерозчинні кальцієві солі жирних кислот:
Утворюється нерозчинне кальцієве мило (стеарат кальцію).
У пробірку з 2 мл розчину розчинного мила додають 1 мл концентрованої НС1. Унаслідок додавання до мила концентрованої соляної кислоти утворюються вільні жирні кислоти:
Спостерігають утворення нерозчинних вільних кислот, які збираються у верхній частині пробірки.
12.4. Якісні реакції на лецитин
Матеріали та реактиви: висушений яєчний жовток, спирт, ацетон, насичений розчин хлориду кадмію CdCl2 в етанолі, 5 %-й спиртовий розчин ваніліну, концентрована сульфатна кислота, фільтр.
Порядок виконання роботи
Лецитин (фосфатидилхолін) є одним із представників фосфоацилгліцеролів, які входять до складу біологічних мембран. Лецитин не розчиняється в ацетоні й утворює стійку емульсію з водою. Якісними реакціями на лецитин є реакції з хлоридом кадмію, з ваніліном та сульфатною кислотою.
У стакан, який містить 200—300 мг розтертого яєчного жовтка, додають 15 мл гарячого спирту і перемішують. Через
10—15 хв суміш охолоджують і фільтрують у суху пробірку. В іншу суху пробірку наливають 2—3 мл ацетону й по краплинах додають одержаний фільтрат. Спостерігають появу каламуті, а потім випадіння осаду лецитину, що свідчить про нерозчинність лецитину в ацетоні. Лецитин
До 2—3 мл фільтрату додають по краплинах дистильовану воду, утвориться стійка емульсія.
До 2—3 мл фільтрату додають таку саму кількість насиченого спиртового розчину хлориду кадмію. Утворюється осад жовтувато-білого кольору.
До 2 мл фільтрату додають 2 краплі 5 %-го спиртового розчину ваніліну, по стінці нашаровують 1 мл концентрованої сульфатної кислоти. Утворюється кільце червоного кольору.
Оброблення експериментальних даних
Напишіть скорочені та структурні формули пальмітинової, стеаринової, арахінової, олеїнової, пальмітоолеїнової, лінолевої, ліноленової, арахідонової кислот. Класифікуйте ці ВЖК.
Побудуйте таблицю, у якій наведіть формули різних класів ліпідів, вкажіть їх біологічну роль, реакції їх виявлення та хімічні властивості.
Наведіть формули різних видів мила. Напишіть реакції утворення рідкого мила з твердого жиру, твердого мила з рідкого жиру, твердого нерозчинного мила з рідкого жиру.
Контрольні запитання та завдання
1. Як класифікуються ліпіди? Які ліпіди відкладаються в жирових депо? Напишіть загальну структурну формулу таких ліпідів. Які ліпіди є головним структурним компонентом біологічних мембран? Напишіть формулу будь-якого з них.
2. Які реакції є спільними в біосинтезі нейтральних ліпідів та фосфоацилгліцеролів? За яких умов синтез фосфоліпідів переважає?
3. Які ви знаєте транспортні форми ліпідів? Із яких структурних компонентів вони складаються? Яке значення має кожна з них?
4. Напишіть реакцію взаємодії ненасиченого ліпіду з бромною водою, реакцію Вагнера з олеїновою кислотою.
5. Що називається милом? Які мила рідкі, а які тверді? Які мила добре розчиняються у воді, а які є нерозчинними? Із яких речовин можна одержати мило? Напишіть рівняння реакцій. Чому рідкі або розчинні тверді мила не використовуються для прання в морській воді?
6. Які метаболічні перетворення характерні для ліпідів?
7.Напишіть реакції анаеробного та аеробного окиснення гліцерину, розрахуйте його енергетику.
8.Розрахуйте енергетичний ефект повного аеробного окиснення молекули тристеарину.
9.Які вітаміни необхідні для метаболізму ліпідів?