ОСНОВЫ БИОХИМИИ ЛЕНИНДЖЕРА - ТОМ 1. ОСНОВЫ БИОХИМИИ СТРОЕНИЕ И КАТАЛИЗ - 2011

ЧАСТЬ I. СТРОЕНИЕ И КАТАЛИЗ

Структура этого просто обязана существовать.

Джеймс Уотсон, Двойная спираль, 1968

8. НУКЛЕОТИДЫ И НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

В клеточном метаболизме нуклеотиды выполняют множество функций. Они переносят энергию для биохимических превращений, играют роль важных химических посредников (вторичных мессенджеров) в ответе клеток на действие гормонов и других внеклеточных стимулов, входят как структурные элементы в состав ряда кофакторов ферментов и метаболических интермедиатов. Наконец, из нуклеотидов построены нуклеиновые кислоты: дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновая кислота (РНК), в которых хранится на молекулярном уровне генетическая информация. Структура каждого белка и, в конечном итоге, всех биомолекул и компонентов клетки определяется данными, закодированными в последовательности нуклеотидов молекул нуклеиновых кислот. Способность хранить и передавать генетическую информацию от одного поколения другому входит в число основных условий жизни.

Эта глава посвящена обзору химических свойств нуклеотидов и нуклеиновых кислот, обнаруженных в большинстве типов клеток; детальное описание функций нуклеиновых кислот дано в части III.

8.1. Основные понятия

Нуклеотиды — блоки, из которых построены нуклеиновые кислоты.Аминокислотная последовательность каждого белка клетки и нуклеотидная последовательность каждой молекулы РНК определены последовательностью нуклеотидов соответствующего участка клеточной ДНК. Участок молекулы ДНК, содержащий необходимую информацию для синтеза биологического продукта с определенной функцией, будь это белок или РНК, называется ген. Обычно в клетке содержится много тысяч генов, и неудивительно, что молекулы ДНК очень велики. Хранение и передача биологической информации — единственная известная функция молекул ДНК.

У РНК более широкий набор функций; в клетке существует несколько разновидностей этих молекул. Рибосомная РНК (рРНК) входит в состав рибосом — сложных комплексов, где происходит синтез белков. Матричная РНК (мРНК) служит посредником, переносящим генетическую информацию от одного или нескольких генов к рибосоме, в которой могут синтезироваться соответствующие белки. Транспортная РНК (тРНК) точно преобразует информацию мРНК в соответствующую последовательность аминокислот. В дополнение к этим основным трем классам существует множество типов РНК со специальными функциями, что более подробно описано в части III.

В состав нуклеотидов и нуклеиновых кислот входят определенные основания и пентозы

Нуклеотиды состоят из трех характерных компонентов: (1) азотистого (азотсодержащего) основания, (2) сахара пентозы и (3) фосфата (рис. 8-1). Молекулу без фосфатной группы называют нуклеозидом. Азотистыми основаниями являются производные двух веществ: пиримидина и пурина. В типичных нуклеотидах основания и пентозы— гетероциклические соединения.

Рис. 8-1. Структура нуклеотидов, а) Принятая нумерация атомов пентозы. Это рибонуклеотид. В дезоксирибонуклеотидах ОН-группа при 2'-атоме углерода (обозначена красным) замещена на -Н. б) Принятая нумерация атомов циклов пурина и пиримидина — соединений, которые служат основой для пуриновых и пиримидиновых оснований нуклеотидов и нуклеиновых кислот.

Ключевые договоренности.

Атомы углерода и азота в исходных структурах пронумерованы общепринятым способом, чтобы облегчить наименование и идентификацию многочисленных производных. Нумерация атомов в пентозном кольце основана на правилах, приведенных в гл. 7, но в пентозах нуклеотидов к номерам атомов углерода добавляется еще знак штриха ('), чтобы отличать их от атомов азотистых оснований. ■

Основание нуклеотида ковалентно соединено (через атом N-1 пиримидинов и атом N-9 пуринов) N-β-гликозидной связью с 1'-углеродом пентозы. 5'-углеродный атом пентозы, в свою очередь, соединяется эфирной связью с фосфатом. N-β-гликозидная связь образуется при удалении воды (гидроксильной группы пентозы и водорода основания), как и О-гликозидная связь (рис. 7-29).

И ДНК, и РНК содержат два главных пуриновых основания: аденин (А) и гуанин (G) и два главных пиримидиновых основания: в ДНК и в РНК — это цитозин (С), но второе пиримидиновое основание различается, в ДНК — это тимин (Т), а в РНК — урацил (U). Изредка тимин встречается в РНК, а урацил в ДНК. Структуры пяти главных оснований показаны на рис. 8-2, а номенклатура соответствующих им нуклеотидов и нуклеозидов представлена в табл. 8-1.

Рис. 8-2. Основные пуриновые и пиримидиновые основания нуклеиновых кислот. Некоторые из этих названий отражают историю их открытия. Гуанин, например, изначально был выделен из гуано (птичьего помета), а тимин — из тимуса.

Таблица 8-1. Нуклеотиды и номенклатура нуклеиновых кислот

Основание

Нуклеозид

Нуклеотид

Нуклеиновая кислота

Пурины




Аденин

Аденозин

Дезоксиаденозин

Аденилат

Дезоксиаденилат

РНК

ДНК

Гуанин

Гуанозин

Дезоксигуанозин

Гуанилат

Дезоксигуанилат

РНК

ДНК

Пиримидины




Цитозин

Цитидин

Дезоксицитидин

Цитидилат

Дезоксицитидилат

РНК

ДНК

Тимин

Тимидин или дезокситимидин

Тимидилат или дезокситимидилат

ДНК

Урацил

Уридин

Уридилат

РНК

Обратите внимание на то, что «нуклеозид» и «нуклеотид» — общие названия, которые включают в себя и рибо-, и деэоксирибоформы. Кроме того, рибонуклеозиды и рибонуклеотиды здесь просто названы нуклеозидами и нуклеотидами (например, рибоаденозин — отоаденозин), а дезоксирибонуклеозиды и дезоксирибонуклеотиды — дезоксинуклеозидами и дезоксинуклеотидами (например, дезоксирибоаденозин — дезоксиаденозин). Оба способа названий приняты, но укороченные варианты используются чаще. Исключением является тимин; термин «риботимидин» используется только в тех случаях, когда тимин включается в структуру РНК.

В состав нуклеиновых кислот входит два типа пентоз. Повторяющиеся дезоксирибонуклеотидные единицы ДНК содержат 2'-дезокси- D-рибозу, а рибонуклеотидные единицы РНК — D-рибозу. В нуклеотидах оба типа пентоз находятся в β-фуранозной форме (замкнутое пятичленное кольцо). Как показано на рис. 8-3, атомы пентозного цикла расположены не в одной плоскости, а находятся в одной из складчатых конформаций.

Рис. 8-3. Конформация рибозы. а) В растворе свободная рибоза принимает две формы: развернутая цепь (альдегид) и замкнутый цикл (β-фураноза), которые находятся в равновесии. В РНК рибоза содержится только в виде цикла, β-D-рибофуранозы. Дезоксирибоза подвергается похожим изменениям в растворе, но в состав ДНК входит только в виде β-2'-дезокси-D-фуранозы. б) Рибофурановый цикл, соединенный с нуклеотидом, может существовать в одной из четырех складчатых конформаций. Во всех случаях четыре из пяти атомов находятся в одной плоскости. Пятый атом (С-2' или С-3') располагается с той же (эндо-) или с другой (экзо-) стороны относительно С-5' атома.

Ключевые договоренности.

Хотя между ДНК и РНК есть два основных отличия — разные пентозы и присутствие урацила в РНК и тимидина в ДНК — именно пентозы определяют особенности этих двух типов кислот. Если нуклеиновая кислота содержит 2'-дезокси-D-рибозу, она по определению является ДНК, даже если в ней есть сколько-то остатков урацила. Аналогичным образом, если нуклеиновая кислота содержит D-рибозу, она представляет собой РНК вне зависимости от нуклеотидного состава. ■

На рис. 8-4. даны структуры и названия четырех главных дезоксирибонуклеотидов (рибонуклеозид-5'-монофосфатов), структурных единиц ДНК, и четырех главных рибонуклеотидов (рибонуклеозид-5'-монофосфатов), структурных единиц РНК.

Рис. 8-4. Дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды нуклеиновых кислот. Все нуклеотиды показаны в свободной форме при pH = 7,0. Нуклеотиды ДНК (о) обычно обозначают как А, G, Т и С, а иногда как dA, dG, dT и dC; а РНК — (б) A, G, U и С. В свободной форме нуклеотиды обычно обозначаются как dAMP, dGMP, dTMP и dCMP; а рибонуклеотиды — AMP, GMP, UMP СМР. Для каждого нуклеотида наиболее часто встречающееся название указано перед полным названием в круглых скобках. Во всех сокращениях подразумевается, что фосфатная группа находится в 5'-положении. Нуклеозидная часть каждой молекулы выделена розовой рамкой. На этом и следующих рисунках атомы углерода углеводного кольца не показаны.

Хотя в состав нуклеотидов входят в основном главные пурины и пиримидины, и в ДНК, и в РНК встречаются некоторые минорные основания (рис. 8-5). В ДНК это чаще всего метилированные формы главных оснований, также в некоторых вирусных ДНК определенные основания могут быть гидроксиметилированы или гликозилированы. Модифицированные или нестандартные основания в молекуле ДНК часто участвуют в регуляции или защите генетической информации. Различные минорные основания найдены также в РНК, особенно в тРНК (см. рис. 8-25 и 26-23).

Ключевые договоренности.

Номенклатура минорных оснований в некотором смысле запутанная. Как и главные основания, большинство из минорных имеют тривиальные названия, например, на рис. 8-5 показана структура гипоксантина в составе нуклеозида инозина. При замещении атома в пуриновом или пиримидиновом цикле в названии нового соединения просто указывается заместитель и номер атома, к которому он присоединен, например, 5-метилцитозин, 7-мстилгуанин и 5-гидроксиметилцитозин (показаны в виде нуклеозидов на рис. 8-5). Элемент, к которому присоединен заместитель (N, С, О), не указывается. Номенклатура меняется, если замещенный атом находится вне циклической структуры; в таком случае указывается тип атома, к которому присоединен заместитель, а также номер атома в кольце в виде верхнего индекса. Атом азота аминогруппы, присоединенной к С-6 атому аденина, называется N6; аналогичным образом, карбонильный кислород и азот аминогруппы, присоединенные к С-6 и С-2 атомам гуанина, называются О6 и N2соответственно. Примерами могут служить N6- метиладенозин и N2-метилгуанозин (рис. 8-5). ■

Рис. 8-5. Некоторые минорные пуриновые и пиримидиновые основания (изредка встречающиеся в нуклеиновых кислотах основания) показаны в виде нуклеозидов. а) Минорные основания ДНК. 5-Метилцитидин встречается в ДНК животных и высших растений, N6-метиладенозин в бактериальной ДНК, а 5-гидроксиметилцитидин в ДНК бактерии, инфицированной определенными бактериофагами. б) Некоторые минорные основания тРНК. В состав инозина входит основание гипоксантин. Обратите внимание на то, что псевдоуридин, как и уридин, содержит урацил; эти соединения различаются между собой местом соединения основания с рибозой — в уридине рибоза связана с N-1 атомом урацила, как и в других пиримидинсодержащих нуклеозидах; в псевдоуридине — с С-5 атомом.

Клетки также содержат нуклеотиды, в которых фосфатные группы соединены не с 5'-углеродом (рис. 8-6). Циклические 2',3'- рибонуклеозидмонофосфаты — это стабильные интермедиаты, которые можно выделить, а 3'- рибонуклеозидмонофосфаты в качестве конечных продуктов образуются при гидролизе РНК определенными рибонуклеазами в качестве конечных продуктов. Другие случаи, такие как циклический 3',5'-аденозинмонофосфат (сАМР) и циклический 3',5'- гуанозинмонофосфат (сGМР), рассматриваются в конце этой главы.

Рис. 8-6. Некоторые монофосфаты аденозина. 2'-Аденозинмонофосфат, 3'-аденозинмонофосфат и циклический 2',3'-аденозинмонофосфат образуются под действием специфических ферментов и при щелочном гидролизе РНК.

Нуклеотиды в нуклеиновых кислотах последовательно связываются фосфодиэфирными связями

Нуклеотиды в ДНК и в РНК ковалентно связаны между собой фосфодиэфирными мостиками, в которых 5'-фосфатная группа одного нуклеотида соединяется с 3'-гидроксильной группой следующего нуклеотида с образованием фосфодиэфирной связи (рис. 8-7). Таким образом, ковалентный остов нуклеиновых кислот состоит из чередующихся остатков фосфата и пентозы, а азотистые основания можно рассматривать как боковые группы, присоединенные к остову регулярно через одинаковые интервалы. Остовы ДНК и РНК гидрофильны. Гидроксильные группы остатков сахара образуют водородные связи с водой. Фосфатные группы имеют рКa - 0 и полностью ионизированы при pH 7, их отрицательные заряды нейтрализуются в основном за счет ионных взаимодействий с положительными зарядами белков, ионов металлов и полиаминов.

Ключевые договоренности.

Все фосфодиэфирные связи в ДНК и РНК направлены одинаково (рис. 8-7), благодаря чему каждая цепочка нуклеиновых кислот ориентирована и имеет разные 3'- и 5'-концы. По определению, у 5'-конца отсутствует нуклеотид в 5'-положении, а у 3'-конца отсутствует нуклеотид в 3'-положении. На одном или обоих концах могут присутствовать другие группы (чаще один или несколько фосфатов). Обозначение ориентации последовательности нуклеиновой кислоты от 5' к 3' относится к концам последовательности, а не к ориентации каждой отдельной фосфодиэфирной связи, соединяющей между собой нуклеотиды. ■

Рис. 8-7. Фосфодиэфирные связи в ковалентном остове ДНК и РНК. Фосфодиэфирные связи (одна из которых выделена в молекуле ДНК) последовательно соединяют нуклеотиды между собой. Остов из чередующихся пентозных и фосфатных групп обладает ярковыраженной полярностью и в ДНК, и в РНК. На 5'-конце макромолекулы отсутствует нуклеотид в 5'-положении, а на 3'-конце отсутствует нуклеотид в 3'-положении.

Фосфодиэфирные связи в молекулах ДНК и РНК подвергаются медленному неферментативному гидролизу. В пробирке РНК гидролизуется довольно быстро в щелочной среде, а ДНК — нет; в этом процессе принимают участие непосредственно 2'-гидроксильные группы РНК (которых нет в ДНК). Первыми продуктами действия щелочи на РНК являются циклические 2',3'- пуклеотидмонофосфаты, которые быстро гидролизуются с образованием смеси 2'-нуклеозид- и 3'-нуклеозидмонофосфатов (рис. 8-8).

Рис. 8-8. Гидролиз РНК в щелочных условиях. 2'-Гидроксильная группа играет роль нуклеофила при внутримолекулярном смещении электронной плотности. 2',3'-Производное циклического монофосфата гидролизуется до смеси 2'- и 3'-монофосфатов. ДНК, в которой отсутствует 2'-гидроксильная группа, в аналогичных условиях стабильна.

Последовательность нуклеотидов в нуклеиновых кислотах можно представить схематически, как показано на следующей странице на примере участка ДНК из пяти нуклеотидов. Фосфатные группы изображены каккаждая дезоксирибоза обозначена вертикальной линией от атома С-1' сверху до атома С-5' внизу (но помните, что сахар в нуклеиновых кислотах всегда находится в замкнутой (3-фуранозной форме). Связи между нуклеотидами (которые проходят через) изображены диагональю от середины (С-3') дезоксирибазы одного нуклеотида до низа (С-5') следующего.

Вот примеры других упрощенных обозначений: рА-С-G-Т-Аон, рАрСрGрТрА и рАСGТА.

Ключевые договоренности.

Исторически сложилось, что последовательность одной цепи нуклеиновой кислоты всегда изображают, начиная с 5'-конца и заканчивая 3'-концом слева направо в направлении 5' —> 3'. ■

Короткие нуклеиновые кислоты называются олигонуклеотидами. Определение «короткие» в некотором смысле произвольное, но полимеры, содержащие 50 и менее нуклеотидов, обычно называются олигонуклеотидами. Болес длинные цепочки нуклеиновых кислот называются полинуклеотидами.

Свойства оснований нуклеотидов влияют на трехмерную структуру нуклеиновых кислот

Свободные пиримидины и пурины обладают слабовыраженными основными свойствами и поэтому называются основаниями. Пурины и пиримидины, встречающиеся в ДНК и в РНК, представляют собой молекулы с сопряженными связями (рис. 8-2), что оказывает большое влияние на структуру, распределение электронов и спектр поглощения света нуклеиновыми кислотами. Делокализация электронов атомов кольца придает большей части связей характер полуторных. Вследствие этого молекулы пиримидинов плоские, пуринов — почти плоские (с одним изгибом). Свободные основания пуринов и пиримидинов могут существовать в двух или более таутомерных формах в зависимости от pH. Урацил, например, может существовать в лактамной, лактимной и дважды лактимной формах (рис. 8-9). На рис. 8-2 показаны структуры, преобладающие в растворе при pH 7,0. Из-за резонанса все азотистые основания поглощают УФ-свет, нуклеиновые кислоты характеризуются максимумом поглощения в районе 260 нм (рис. 8-10).

Рис. 8-9. Таутомерные формы урацила. Лактамная форма преобладает при pH 7,0; другие формы становятся более заметными при понижении pH. Другие пиримидины и пурины в свободном состоянии также могут принимать различные таутомерные формы, но они встречаются намного реже.

Рис. 8-10. Спектр поглощения основных нуклеотидов. Спектр показан как зависимость коэффициента молярной экстинкции от длины волны. Коэффициенты молярной экстинкции при 260 нм и pH 7,0 (ε260) приведены в таблице. Спектры соответствующих рибонуклеотидов и дезок- сирибонуклеотидов, так же, как и нуклеозидов, практически идентичны. Для измерения поглощения смеси нуклеотидов используется длина волны 260 нм (пунктирная вертикальная линия).

Пуриновые и пиримидиновые основания гидрофобии и плохо растворимы в воде при близких к нейтральным значениях pH в клетке. В кислых и щелочных средах основания становятся заряженными, и увеличивается их растворимость в воде. Гидрофобные взаимодействия между соседними основаниями, плоскости колец которых расположены параллельно друг другу (как стопка монет), представляют собой один из двух наиважнейших типов нековалентных связей между основаниями в нуклеиновых кислотах. Связь между параллельными плоскостями оснований (так называемые стекинговые взаимодействия, от англ, stacking interactions) осуществляется также за счет ван-дер-ваальсовых сил и диполь-дипольных взаимодействий. Упаковка оснований в виде стопки монет приводит к уменьшению количества контактов оснований с водой, а взаимодействия между параллельными основаниями очень важны для стабилизации трехмерной структуры нуклеиновых кислот, как будет описано ниже.

Наиболее важные функциональные группы пиримидинов и пуринов — это атомы азота кольца, карбонильные группы и аминогруппы, не участвующие в образовании цикла. Водородные связи между амино- и карбонильными группами служат вторым важнейшим типом взаимодействий между основаниями в нуклеиновых кислотах. Водородные связи между основаниями обеспечивают комплементарную ассоциацию между двумя (и изредка тремя или четырьмя) спиралями нуклеиновых кислот. Атомы, участвующие в образовании водородных связей, были определены Джеймсом Д. Уотсоном и Френсисом Криком в 1953 г. Они выяснили, что аденин А специфически связывается с тимином Т (или U), а гуанин G — с цитозином С (рис. 8-11). Эти два типа пар оснований преобладают в структуре двойных спиралей ДНК и РНК, за такой тип организации нуклеиновых кислот ответственны таутомеры, показанные на рис. 8-2. Это специфическое образование пар оснований обеспечивает стабильность процесса удвоения генетической информации, как мы увидим позже в этой главе.

Рис. 8-11. Водородные связи в парах оснований, определенные Уотсоном и Криком. Здесь, как и везде, водородные связи изображены тремя голубыми линиями.

Краткое содержание раздела 8.1 Основные понятия

■ Нуклеотиды содержат азотистые основания (пурины или пиримидины), пентозу и одну или несколько фосфатных групп. Нуклеиновые кислоты представляют собой полимеры нуклеотидов, соединенных друг с другом фосфодиэфирными связями между 5'-гидроксильной группой пентозы одного нуклеотида и 3'-гидроксильной группой другого.

■ Существуют два типа нуклеиновых кислот: РНК и ДНК. Нуклеотиды в РНК содержат рибозу и главные пиримидиновые основания уранил и цитозин. В ДНК нуклеотиды содержат 2'-дезоксирибозу и главные пиримидиновые основания тимин и цитозин. Типичными пуринами и в ДНК, и в РНК являются аденин и гуанин.