ОСНОВЫ БИОХИМИИ ЛЕНИНДЖЕРА - ТОМ 1. ОСНОВЫ БИОХИМИИ СТРОЕНИЕ И КАТАЛИЗ - 2011

ЧАСТЬ I. СТРОЕНИЕ И КАТАЛИЗ

10. ЛИПИДЫ

10.4. Методы анализа липидов

Поскольку липиды нерастворимы в воде, их экстракция и последующее разделение требуют использования органических растворителей и некоторых методик, которые нс применяются при очистке водорастворимых веществ, таких как белки или углеводы. Общий подход к разделению сложных смесей липидов основан на различиях в их полярности или растворимости в неполярных растворителях. Для последующего анализа липиды, которые содержат жирные кислоты, связанные сложноэфирной или амидной связью, можно гидролизовать, обработав кислотой, щелочью или высокоспецифичными гидролитическими ферментами (фосфолипазы, гликозидазы). Некоторые методы, широко применяемые для анализа липидов, представлены на рис. 10-24 и обсуждаются ниже.

Для экстракции липидов требуются органические растворители

Нейтральные липиды (триацилглицериды, воски, пигменты и др.) легко экстрагируются из тканей этиловым эфиром, хлороформом или бензолом, растворителями, которые не допускают ассоциации липидов, обусловленной их гидрофобными свойствами. Мембранные липиды эффективнее экстрагируются более полярными растворителями, такими как этанол или метанол, которые уменьшают гидрофобные взаимодействия между липидными молекулами, ослабляя в то же время водородные связи и электростатические взаимодействия, связывающие мембранные липиды с мембранными белками. Наиболее часто применяемым экстракционным агентом является смесь хлороформа, метанола и воды в соотношении (1:2:0,8 по объему). В этом соотношении растворители хорошо смешиваются, образуя одну фазу. После того как ткань гомогенизируют в растворителе для экстракции всех липидов, к полученному экстракту добавляют некоторое количество воды, и смесь расслаивается на две фазы — водно-метанольную (верхняя фаза) и хлороформенную (нижняя фаза). Липиды остаются в хлороформенном слое, а более полярные молекулы, такие как белки и сахара, попадают в водно-метанольный слой.

Методом адсорбционной хроматографии разделяют липиды разной полярности

Сложные смеси тканевых липидов можно разделить на фракции с помощью хроматографических методов, основанных на различной полярности липидов разных типов. В адсорбционной хроматографии (рис. 10-24, б) нерастворимый полярный материал, такой как силикагель (форма кремниевой кислоты Si(ОН)₄), помещают в стеклянную колонку, а смесь липидов (в виде хлороформенного раствора) добавляют в верхнюю часть колонки. (При высокоэффективной жидкостной хроматографии колонка меньшего диаметра, а растворители продавливаются через колонку под высоким давлением.) Полярные липиды прочно связываются с полярной кремневой кислотой, нейтральные же липиды проходят через колонку и выходят при первой промывке хлороформом. Затем вымываются полярные липиды, они выходят в порядке увеличения полярности при промывании колонки растворителями с постепенно возрастающей полярностью. Незаряженные, но полярные липиды (например, цереброзиды) вымываются ацетоном, а очень полярные или заряженные липиды (такие как глицерофосфолипиды) элюируются метанолом.

В тонкослойной хроматографии на кремневой кислоте используется тот же принцип (рис. 10-24, в). Тонкий слой силикагеля распределен по стеклянной пластинке, к которой он прилипает. Небольшое количество липидов, растворенных в хлороформе, наносят близко к краю пластинки, которую погружают в плоский контейнер с органическим растворителем или смесью растворителей. Все это находится внутри камеры, насыщенной парами растворителя. Поднимаясь по пластинке вследствие капиллярного эффекта, растворитель несет с собой липиды. Менее полярные липиды продвигаются дальше, так как они обладают меньшим стремлением к связыванию с кремниевой кислотой. Разделенные липиды можно обнаружить, опрыскивая пластинку красителем (родамином), который флуоресцирует при связывании с липидами, или выдерживая липиды в парах иода. Иод обратимо реагирует с двойными связями в жирных кислотах, так что липиды, содержащие ненасыщенные жирные кислоты, дают желтую или коричневую окраску. Для обнаружения специфических липидов используется ряд других реагентов. Для последующего анализа участки, содержащие разделенные липиды, соскабливают с пластинки, и вновь экстрагируют липиды органическим растворителем.

Рис. 10-24. Обычные процедуры при экстракции, разделении и идентификации клеточных липидов, а) Ткань гомогенизируют в смеси хлороформ/метанол/вода. После добавления воды и удаления неэкстрагируемого осадка центрифугированием получаются две фазы. Различные типы экстрагированных липидов в хлороформенной фазе могут быть разделены адсорбционной хроматографией (б) на колонке из силикагеля, через которую пропускаются растворители с увеличивающейся полярностью, или (в) с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ), когда липиды переносятся восходящим фронтом растворителя вверх по пластинке, покрытой силикагелем, при этом менее полярные липиды проходят дальше, чем более полярные или заряженные. При использовании подходящих растворителей ТСХ можно применить для разделения родственных липидов; например, заряженные липиды фосфатидилсерин, фосфатидилглицерин и фосфатидилинозит легко разделяются методом ТСХ.

Для определения состава жирных кислот липидная фракция, содержащая связанные сложноэфирной связью жирные кислоты, переэтерифицируется в горячем водном растворе NаОН и метанола (г) для получения смеси метиловых эфиров жирных кислот. Эти метиловые эфиры затем разделяют по длине углеродной цепочки и степени ненасыщенности методом (д) газожидкостной хроматографии (ГЖХ) или методом (е) высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Определение молекулярной массы с помощью масс-спектрометра делает возможным однозначно идентифицировать индивидуальные липиды.

Методом газожидкостной хроматографии разделяют смеси летучих производных липидов

Методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) разделяют летучие компоненты смеси в соответствии с их относительной способностью растворяться в инертном материале, наполняющем хроматографическую колонку, улетучиваться и двигаться через колонку с потоком инертного газа, например, гелия. Некоторые липиды летучи от природы, но большинство приходится сначала подвергать превращению в производные с увеличенной летучестью (т. е. более низкой температурой кипения). Для анализа жирных кислот образец фосфолипидов сначала нагревают в смеси метанол/НСl или метанол/NаОН, при этом жирные кислоты, связанные сложноэфирной связью с глицерином, превращаются в метиловые эфиры (происходит переэтерификация; рис. 10-24, г). Эти метиловые эфиры жирных кислот затем загружают в газожидкостную хроматографическую колонку, колонку нагревают, чтобы сделать компоненты летучими. Эфиры жирных кислот, которые лучше растворяются в материале, наполняющем колонку, переходят в раствор; менее растворимые липиды уносятся потоком инертного газа и первыми выходят из колонки. Порядок элюирования зависит от природы твердого адсорбента в колонке и от температуры кипения компонентов липидной смеси. Таким образом удается полностью разделить на компоненты смеси жирных кислот с различной длиной углеродной цепи и различной степенью ненасыщенности (рис. 10-24, д).

Специфический гидролиз помогает определить структуру липида

Некоторые классы липидов при определенных условиях подвергаются деградации. Например, все жирные кислоты, связанные сложноэфирной связью в триацилглицеридах, фосфолипидах и эфирах стеринов, высвобождаются посредством мягкой обработки кислотами или щелочами, а при несколько более жестких условиях гидролиза высвобождаются связанные амидной связью жирные кислоты из сфинголипидов. Ферменты, которые специфически гидролизуют определенные липиды, также используются при установлении структуры липида. Каждая из фосфолипаз А, С и D (рис. 10-16) расщепляет определенные связи в фосфолипидах с образованием продуктов, обладающих характерными растворимостью и хроматографическим поведением. Например, фосфолипаза С высвобождает растворимый в воде фосфорилированный спирт (так, из фосфатидилхолина получается фосфохолин) и растворимый в хлороформе диацилглицерин. Каждый из них можно охарактеризовать по отдельности для определения структуры исходного фосфолипида. При комбинации специфического гидролиза и анализа продуктов гидролиза с помощью методов тонкослойной, газожидкостной или высокоэффективной жидкостной хроматографии часто удается расшифровать структуру липида.

Методом масс-спектрометрии можно полностью расшифровывать структуру липида

Для однозначного определения длины углеводородной цепочки или положения двойных связей применяют метод масс-спектрометрического анализа липидов или их летучих производных. Химические свойства родственных липидов (например, двух жирных кислот, близких по длине углеродной цепи и с ненасыщенными связями в разных положениях, или двух изопреноидов с разным числом изопреновых единиц) очень сходны. Их положение на хроматограммах часто не даст возможности обнаружить различия между ними. Однако, когда элюат, выходящий с хроматографической колонки, анализируют с помощью масс-спектрометрии, можно одновременно разделить и идентифицировать компоненты липидной смеси по характерной картине фрагментации (рис. 10-25).

Рис. 10-25. Определение структуры жирной кислоты с помощью масс-спектрометра. Жирная кислота превращается в производное, обеспечивающее минимизацию миграции двойных связей в процессе фрагментации молекулы электронной бомбардировкой. Производное — пиколиновый эфир линолевой кислоты (18:2(∆^9,12); Мr =371) содержит спирт пиколинол (красный цвет). При бомбардировке потоком электронов эта молекула превращается в исходный ион (М⁺; Мr = 371), в котором атом N несет положительный заряд и ряд более мелких фрагментов, образующихся при разрыве связей С-С в жирной кислоте. Масс-спектрометр разделяет эти заряженные фрагменты в соответствии с соотношением масса/заряд (m/z). (Для ознакомления с основами масс-спектрометрии см. доп. 3-2.)

На масс-спектре хорошо выявляются ионы с m/z = 92,108,151 и 164. Они содержат пиридиновое кольцо пиколинола и различные фрагменты карбоксильной группы. Это доказывает, что изучаемое соединение действительно пиколиновый эфир. Молекулярный ион (m/z = 371) подтверждает присутствие жирной кислоты С-18 с двумя двойными связями. Одинаковая группа ионов с массой 14 единиц (u) представляет потерю каждой последующей метильной или метиленовой группы с метильного конца ацильной цепочки (начиная с С-18; здесь — правый конец молекулы), пока не достигается ион с m/z = 300. Затем следует интервал в 26 единиц u — углеводороды с двойной связью в конце цепи, m/z = 274; далее интервал в 14 единиц u — отщепление метиленовой группы С-11, m/z = 260 и т. д. Таким образом определяют полную структуру, хотя одни только эти данные сами по себе не дают информации о конфигурации (цис- или транс-) двойных связей.

Липидомика занимается классификацией липидов и их функций

При изучении биологической роли липидов в клетках и тканях важно знать, какие липиды и в каком количестве присутствуют в данной клетке или ткани, а также каким образом липидный состав меняется в процессе эмбрионального развития, при различных заболеваниях и при приеме определенных лекарств. Современным ученым, занимающимся изучением липидов, известны уже тысячи природных липидов, поэтому была введена новая система номенклатуры, позволяющая упростить использование баз данных липидных структур. В этой системе каждый липид относят к одной из восьми групп (табл. 10-3), обозначаемых двумя буквами. Внутри групп липиды распределены по классам и подклассам с соответствующими номерами. Например, все глицерофосфохолины имеют обозначение GР01; глицерофосфохолины с двумя жирными кислотами в сложноэфирной связи обозначаютGР0101, а те, что имеют один остаток жирной кислоты, присоединенный по положению 1, а другой остаток, присоединенный по положению 2, обозначают GР0102. Жирные кислоты обозначают номерами, так что каждый конкретный липид имеет свой собственный идентификаци

онный номер, и все липиды, включая еще не открытые, могут быть однозначно описаны с помощью 12-значного идентификационного номера. Одним из факторов, учитывающихся в данной классификации, является природа вещества- предшественника в биосинтезе. Например, пре- нолы (такие как долихолы и витамины Е и К) образуются из изопренильных предшественников. К поликетидам, не обсуждавшимся в данной главе, относятся некоторые природные вещества (среди них много токсичных), путь биосинтеза которых связан с биосинтезом жирных кислот. Восемь категорий, представленных в табл. 10-3, не совпадают полностью с той классификацией по биологическим функциям, которой мы пользовались в настоящей главе. Например, к структурным липидам мембран мы отнесли как глицерофосфолипиды, так и сфинголипиды, а в табл. 10-3 они попали в разные категории. Заметим, что у каждого способа классификации есть свои преимущества.

Таблица 10-3. Восемь основных категорий природных липидов

Если проанализировать липидный состав клетки с помощью метода масс-спектрометрии, можно составить полный количественный каталог липидов данной клетки — так называемый липидом — в конкретных физиологических условиях; кроме того, можно проанализировать изменения, происходящие с клеточными липидами в процессе дифференцировки, при раковых заболеваниях, при приеме тех или иных лекарств и т. д. В животной клетке содержится около тысячи различных липидов, причем каждый из них выполняет какую- то свою функцию. На сегодняшний день известны функции достаточно большого числа липидов, однако многое еще предстоит узнать.

Краткое содержание раздела 10.4 Методы анализа липидов

■ При определении состава липиды сначала экстрагируют из тканей органическими растворителями, затем разделяют методами тонкослойной, газожидкостной или высокоэффективной жидкостной хроматографии.

■ Чтобы получить более простые соединения для последующего анализа, могут использоваться фосфолипазы, специфические для одной из связей в фосфолипиде.

■ Липиды идентифицируют по хроматографическому поведению, чувствительности к гидролизу специфическими ферментами или с помощью масс-спектрометрии.

■ В липидомике применяются мощные аналитические методы для определения полного липидного состава клетки или ткани (липи- дома), а также для создания аннотированных без данных, позволяющих сравнивать между собой липиды из клеток разных типов и находящиеся в различных условиях.