ОСНОВЫ БИОХИМИИ ЛЕНИНДЖЕРА - ТОМ 2. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ - 2014
ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ
14. ГЛИКОЛИЗ, ГЛЮКОНЕОГЕНЕЗ И ПЕНТОЗОФОСФАТНЫЙ ПУТЬ
Вопросы и задачи
1. Уравнение для подготовительной стадии гликолиза.
Напишите уравнения химического баланса для всех реакций разложения глюкозы до двух молекул глицеральдегид-3-фосфата (подготовительная стадия гликолиза) и укажите для каждой реакции изменение стандартной свободной энергии. Затем напишите суммарное уравнение всей подготовительной стадии гликолиза и приведите суммарное изменение стандартной свободной энергии.
2. Вторая стадия гликолиза в скелетных мышцах (стадия «выплаты процентов»).
В работающей мышце при анаэробных условиях глицеральдегид-3-фосфат превращается в пируват (вторая стадия гликолиза), а пируват далее восстанавливается до лактата. Напишите уравнения всех химических реакций с указанием изменения стандартной свободной энергии в каждом случае. Затем напишите суммарное уравнение второй стадии гликолиза (с лактатом в качестве конечного продукта) и приведите суммарное изменение стандартной свободной энергии.
3. Переносчики глюкозы.
Сравните локализацию GLUT4 с локализацией GLUТ2 и GLUТ3 и объясните, какую роль она играет в реакции на сигнал инсулина в мышцах, жировой ткани, головном мозге и печени.
4. Образование этилового спирта в дрожжах.
При выращивании на глюкозе в анаэробных условиях дрожжи S. cerevisiae превращают пируват в ацетальдегид, а затем восстанавливают ацетальдегид до этанола, заимствуя электроны у NАDН. Напишите уравнение второй реакции и рассчитайте константу равновесия этой реакции при 25 °С, используя значение стандартного восстановительного потенциала, указанное в табл. 13-7.
5. Изменение энергии при альдолазной реакции.
Альдолаза катализирует гликолитическую реакцию:
Фруктозо-1,6-бисфосфат —> глицеральдегид-3-фосфат + дигидроксиацетонфосфат
Изменение стандартной свободной энергии в этой реакции (в указанном направлении) составляет +23,8 кДж/моль. Концентрации трех промежуточных продуктов в гепатоцитах млекопитающих следующие:
фруктозо-1,6-бисфосфат 1,4 • 10-5М;
глицеральдегид-3-фосфат 3,0 • 10-6 М;
дигидроксиацетонфосфат 1,6 • 10-5 М.
Каково изменение свободной энергии в реальной системе при темпетаруре тела (37 °С)?
6. Судьба атомов углерода в процессе брожения.
Опыты с радиоактивной меткой (углерод 14С) проводят на дрожжевом экстракте в строго анаэробных условиях, обеспечивающих спиртовое брожение. Небольшое количество меченного радиоактивным углеродом субстрата инкубируют с дрожжевым экстрактом в течение времени, необходимого, чтобы каждый промежуточный продукт брожения успел включить метку. Затем метку «прогоняют» по всему пути, добавляя избыток немеченой глюкозы. Эта процедура предотвращает участие меченой глюкозы в других метаболических путях.
а) Объясните, в каком положении в молекуле этанола окажется метка, если в качестве субстрата использовать глюкозу, меченную 14 С по положению С-1.
б) В каком положении в меченой глюкозе должна находиться метка, чтобы весь радиоактивный углерод обнаруживался в виде 14СO2, образующегося при спиртовом брожении? Объясните ответ.
7. Тепловой эффект ферментации.
В крупномасштабных промышленных процессах ферментации обычно требуется постоянное и активное охлаждение ферментера. Объясните этот факт.
8. Соевый соус.
Соевый соус готовят путем сбраживания подсоленной смеси соевых бобов и пшеницы под действием нескольких микроорганизмов, в том числе дрожжей, в течение 8-12 месяцев. Оставшийся после удаления твердых частиц соус содержит много лактата и этилового спирта. Как образуются эти продукты? Почему для предотвращения сильного привкуса уксуса брожение следует осуществлять при полном отсутствии кислорода? (Уксус — это разбавленная уксусная кислота.)
9. Эквивалентность триозофосфатов.
К дрожжевому экстракту добавили 14С-меченный гли- церальдегид-3-фосфат. Через короткий промежуток времени был выделен фруктозо-1,6-бисфосфат, содержащий метку в положениях С-3 и С-4. Где находилась метка в исходном глицеральдегид-3- фосфате? Откуда взялся второй меченый атом углерода в фруктозо-1,6-бисфосфате? Объясните ответ.
10. «Укороченный» гликолиз.
Представьте себе, что обнаружен мутант дрожжей с более коротким путем гликолиза, который катализирует новый фермент:
Принесет ли такое укорочение гликолитического пути пользу клетке? Объясните.
11. Роль лактатдегидрогеназы.
При напряженной работе мышц сильно возрастает потребность мышечной ткани в АТР. В мышцах лап кролика или крыльев индейки АТР образуется почти исключительно путем молочнокислого брожения. Образование АТР происходит на второй стадии гликолиза в двух реакциях, катализируемых фосфоглицерат- киназой и пируваткиназой. Представим себе, что в скелетных мышцах отсутствует лактатдегидрогеназа. Смогли бы в таком случае мышцы выполнять напряженную физическую работу, т. е. смогли бы они с большой скоростью вырабатывать АТР путем гликолиза? Поясните ответ.
12. Эффективность образования АТР в мышцах.
В миоцитах превращение глюкозы в лактат сопровождается высвобождением лишь 7% свободной энергии по сравнению с той энергией, которая высвобождается при полном окислении глюкозы до СO2 и воды. Означает ли это, что при анаэробном гликолизе в мышцах глюкоза расходуется неэкономно? Объясните свой ответ.
13. Изменение свободной энергии при окислении триозофосфата.
Окисление глицеральдегид- 3-фосфата до 1,3-бисфосфоглицерата, катализируемое глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой, происходит с неблагоприятной константой равновесия (К'eq = 0,08; ∆G′° = 6,3 кДж/моль). Каким образом клетка преодолевает неблагоприятное равновесие?
14. Отравление арсенатом.
Арсенат по строению и химическим свойствам напоминает неорганический фосфат Pi, и многие ферменты, использующие фосфат, также могут использовать и арсенат. Однако органические арсенаты менее устойчивы, чем аналогичные соединения фосфора. Например, ациларсенаты быстро гидролизуются:
В отличие от них ацилфосфаты, например, 1,3-бис- фосфоглицерат, более устойчивы и подвергаются в клетке только ферментативным превращениям.
а) Как повлияет замена фосфата арсенатом на суммарную реакцию, катализируемую глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой?
б) Какие последствия для организма может вызвать замена фосфата на арсенат? Для большинства организмов арсенат очень токсичен. Объясните, с чем это связано.
15. Потребность в фосфате для спиртового брожения.
В 1906 г. Гарден и Янг провели серию классических исследований сбраживания глюкозы до этанола и СО2 под действием экстракта пивных дрожжей и сделали следующие выводы. 1) Для сбраживания необходим неорганический фосфат; при исчерпании фосфата брожение прекращается даже при наличии глюкозы. 2) При брожении в данных условиях накапливаются этанол, СО2 и гексозобисфосфат. 3) При замене фосфата арсенатом гексозобисфосфат не накапливается, а процесс сбраживания проходит до полного превращения глюкозы в этанол и СО2.
а) Почему процесс останавливался при исчерпании фосфата?
б) Почему накапливались этанол и СО2? Определите, какой гексозобисфосфат накапливался в смеси. Почему он накапливался?
в) Почему при замене фосфата на арсенат не наблюдалось накопления гексозобисфосфата, даже если процесс брожения проходил до конца до этанола и СО2? (См. задачу 10.)
16. Роль ниацина.
Взрослый человек, занятый активным физическим трудом, при нормальном питании должен потреблять в сутки около 160 г углеводов, но лишь 20 мг ниацина. Объясните это с учетом роли ниацина в гликолизе.
17. Синтез глицерофосфата.
Необходимый для синтеза глицерофосфолипидов 3-фосфоглицерат может быть образован из промежуточных продуктов гликолиза. Предложите последовательность реакций для данного превращения.
18. Клинические проявления ферментативной недостаточности.
Клинические проявления двух форм галактоземии (дефицит галактокиназы или галактозо-1-фосфат- уридилилтрансферазы) совершенно различны по тяжести. В обоих случаях после употребления молока наблюдаются кишечные расстройства, однако при недостаточности трансферазы, кроме того, страдают печень, почки, селезенка, нарушается деятельность мозга и может наступить смерть. Какие продукты накапливаются в крови и тканях в каждом из этих случаев ферментативной недостаточности? Сравните токсичность этих продуктов на основании приведенных выше данных.
19. Истощение мышц при голодании.
Одним из последствий голодания является уменьшение мышечной массы. Что происходит с белками мышечной ткани?
20. Путь превращения атомов углерода в глюконеогенезе.
Печеночный экстракт, способный катализировать все метаболические реакции, происходящие в печени в норме, непродолжительное время инкубировали в двух отдельных опытах со следующими 14С-мечеными предшественниками:
Проследите путь обоих предшественников в глюконеогенезе. Укажите положение метки во всех интермедиатах и в конечном продукте — глюкозе.
21. Энергетическая ценность цикла гликолиза и глюконеогенеза.
Какова энергетическая ценность (в эквивалентах АТР) превращения глюкозы в пируват в процессе гликолиза и обратно в глюкозу в процессе глюконеогенеза?
22. Связь между глюконеогенезом и гликолизом.
Почему так важно, что глюконеогенез не является точной копией процесса, обратного гликолизу?
23. Изменение энергии в ходе пируваткиназной реакции.
Объясните в терминах биоэнергетики, каким образом превращение пирувата в фосфоенолпируват в ходе глюконеогенеза преодолевает большое отрицательное значение стандартного изменения свободной энергии пируваткиназной реакции в ходе гликолиза.
24. Глюкогенные субстраты.
Для определения эффективности различных веществ в качестве предшественников глюкозы экспериментальных животных обычно заставляют голодать до тех пор, пока не будут исчерпаны запасы гликогена в печени, а затем дают им в пищу исследуемое вещество. Субстрат, приводящий к суммарному повышению уровня гликогена в печени, называют глюкогенным, поскольку сначала он превращается в глюкозо-6-фосфат. С помощью известных вам ферментативных реакций покажите, какие из указанных ниже веществ являются глюкогенными.
25. Этиловый спирт влияет на уровень глюкозы в крови.
Употребление алкоголя (этилового спирта), особенно после активных физических упражнений или на голодный желудок, приводит к снижению уровня глюкозы крови (гипогликемии). Первой стадией метаболизма этанола в печени является его окисление до ацетальдегида, катализируемое алкогольдегидрогеназой печени:
СН3СН2ОН + NАD+ —> СН3СНО + NАDН + Н+
Объясните, каким образом данная реакция ингибирует превращение лактата в пируват. Почему это приводит к гипогликемии?
26. Изменение уровня лактата в крови при физической нагрузке.
На графике показана концентрация лактата в плазме крови до, вовремя и после бега на 400 метров.
а) Почему происходит резкое увеличение концентрации лактата?
б) С чем связано уменьшение концентрации лактата после завершения бега? Почему уменьшение концентрации происходит медленнее, чем увеличение?
в) Почему в состоянии покоя уровень лактата не равен нулю?
27. Связь между фруктозо-1,6-бисфосфатом и уровнем лактата в крови.
Врожденный дефект печеночного фермента фруктозо-1,6- бисфосфатазы приводит к аномально высокому уровню лактата в плазме крови. Объясните причину.
28. Влияние флоридзина на метаболизм углеводов.
Флоридзин — токсичный гликозид из коры грушевого дерева — блокирует всасывание глюкозы из почечных канальцев, в результате чего глюкоза из крови практически полностью выводится с мочой. В эксперименте крысы, питавшиеся флоридзином и сукцинатом натрия, выделяли около 0,5 моль глюкозы (образовавшейся в результате глюконеогенеза) на каждый моль потребленного сукцината натрия. Каким образом сукцинат превращался в глюкозу? Объясните стехиометрию процесса.
29. Избыточное потребление O2 в процессе глюконеогенеза.
Поглощаемый печенью лактат превращается в глюкозу, при этом на образование каждой молекулы глюкозы затрачивается 6 молекул АТР. За интенсивностью данного процесса в печени крысы можно следить, вводя меченный радиоактивной меткой лактат и измеряя количество образовавшейся 14С-глюкозы. Поскольку стехиометрия потребления O2 с образованием АТР известна (около 5 молекул АТР на молекулу O2), можно предсказать, сколько кислорода расходуется дополнительно при введении данного количества лактата. Однако фактически измеренное количество дополнительного кислорода, затраченного на синтез глюкозы из лактата, всегда оказывается выше предсказанного на основании стехиометрии. Предложите возможное объяснение этого явления.
30. Роль пентозофосфатного пути.
Если в пентозофосфатном пути окисление глюкозо- 6-фосфата использовалось бы главным образом для образования NАDРН, происходило бы накопление другого продукта — рибозо-5- фосфата. Какие проблемы могли бы при этом возникать?
Анализ экспериментальных данных
31. Проектирование ферментативного процесса.
Ферментативная переработка растительного сырья для производства этанола в качестве альтернативного топлива является одним из путей сокращения использования ископаемых ресурсов; реализация подобного процесса позволила бы снизить выброс СO2 в атмосферу и препятствовала глобальному потеплению. Существует множество микроорганизмов, способных расщеплять целлюлозу, а затем превращать глюкозу в этанол. Однако многие потенциальные источники целлюлозы, включая отходы сельского хозяйства и некоторые сельскохозяйственные культуры, такие как просо, содержат значительное количество арабинозы, которая плохо ферментируется.
Бактерия Escherichia coli способна превращать арабинозу в этанол, но природные штаммы плохо переносят высокое содержание спирта, что ограничивает возможность их применения для промышленного производства этанола. Другая бактерия, Zymomonas mobilis, может существовать в среде с высоким содержанием этанола, но не обладает способностью ферментировать арабинозу. Динда, Жанг, Эдди и Пикатаджио (1996) описали свои попытки комбинировать полезные свойства этих двух организмов путем введения генов Е. coli, ответственных за расщепление арабинозы, в клетки Z. mobilis.
а) Почему этот путь реализовать проще, чем создать клетки Е. coli, толерантные к более высокой концентрации этанола?
Динда с коллегами встроили в геном Z. mobilis пять генов Е. coli: аrаА, кодирующий L-арабинозоизомеразу, которая осуществляет взаимные превращения L-арабинозы и L-рибулозы; аrаВ, кодирующий L-рибулокиназу, использующую АТР для фосфорилирования L-рибулозы по положению С-5; araD, кодирующий L-рибулозо-5-фосфатэпимеразу, осуществляющую взаимные превращения L-рибулозо- 5-фосфата и L-ксилулозо-5-фосфата; talB, кодирующий трансальдолазу, а также trtA, кодирующий транскетолазу.
б) Кратко опишите три реакции, катализируемые продуктами генов ага, и, если сможете, назовите упоминавшиеся в настоящей главе ферменты, которые катализируют аналогичные реакции.
Встраивание пяти генов Е. coli в геном Z. mobilis позволило ввести арабинозу в неокислительную фазу пентозофосфатного пути (рис. 14-22), где она превращалась в глюкозо-6-фосфат с дальнейшей ферментацией до этанола.
в) В какой сахар в итоге превращали арабинозу продукты трех генов аrа?
г) Этот сахар (см. вопрос (в)) поступает в процесс, изображенный на рис. 14-22. Опишите общий процесс ферментации шести молекул арабинозы до этанола, учитывая вклад пяти перечисленных выше ферментов Е. coli и ферментов данного пути.
д) Какова стехиометрия превращения шести молекул арабинозы в этанол и СO2? Сколько молекул АТР могло бы образоваться в данном процессе?
е) Z. mobilis использует несколько иной путь ферментации, чем тот, что был описан в данной главе. В результате превращение каждой молекулы арабинозы сопровождается выделением лишь одной молекулы АТР. Это менее выгодно для бактерии, зато более выгодно для производства этанола. Как вы думаете, почему?
В растительном сырье часто встречается другой сахар — ксилоза.
ж) Какие дополнительные ферменты необходимо ввести в описанные выше модифицированные клетки Z. mobilis, чтобы они приобрели способность превращать в этанол не только арабинозу, но и ксилозу? От вас не требуется дать название каждого фермента (возможно, они даже не существуют в природе); просто приведите необходимые реакции.