ОСНОВЫ БИОХИМИИ ЛЕНИНДЖЕРА - ТОМ 2. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ - 2014

ЧАСТЬ II. БИОЭНЕРГЕТИКА И МЕТАБОЛИЗМ

20. БИОСИНТЕЗ УГЛЕВОДОВ У РАСТЕНИЙ И БАКТЕРИЙ

20.2. Фотодыхание, С₄- и САМ-пути

Как мы видели, в фотосинтезирующих клетках в световых реакциях (гл. 19) образуется O₂ (из Н₂O), а в светонезависимых реакциях потребляется СО₂, поэтому при фотосинтезе происходит изменение газового состава окружающей среды — поглощение СO₂ и высвобождение O₂.

СO₂ + Н₂O —> O₂ + (СН₂O)

В темноте растения осуществляют также митохондриальное дыхание — окисление субстратов до СO₂ и восстановление O₂ до Н₂O. Однако у растений происходит и другой процесс, при котором, как и при митохондриальном дыхании, потребляется O₂ и выделяется СO₂, и который, как фотосинтез, управляется светом. Этот процесс фотодыхания — дорогостоящая реакция фотосинтеза по причине недостаточной специфичности фермента рубиско. В следующем разделе мы опишем эту побочную реакцию и стратегии, которые используются растениями для минимизации ее метаболических последствий.

Фотодыхание — следствие оксигеназной активности рубиско

Рубиско не имеет абсолютной специфичности в отношении СO₂ как субстрата. Молекулярный кислород (O₂) конкурирует с СO₂ за активный центр, и через каждые три-четыре оборота рубиско катализирует одну конденсацию O₂ с рибулозо-1,5-бисфосфатом с образованием 3-фосфоглицерата и 2-фосфогликолата (рис. 20-20), метаболически бесполезного продукта. В этом и проявляется оксигеназная активность этого фермента, которая отражена в его полном названии: рибулозо-1,5-бисфосфат- карбоксилаза/оксигеназа. В результате реакции с O₂ не происходит фиксации углерода, и в итоге такая реакция оказывается обузой для клетки; усвоение атомов углерода из 2-фосфогликолата требует от клетки много энергии и высвобождает некоторое количество ранее фиксированного углекислого газа.

Если реакция с кислородом вредна для организма, то почему же в ходе эволюции активный центр рубиско не «научился» различать O₂ и СO₂? Возможно, большинство эволюционных изменений фермента произошла около 2,5 млрд лет назад, еще до того времени, как фотосинтезирующие организмы начали повышать содержание кислорода в атмосфере, т. е. это было тогда, когда рубиско не требовалось различать O₂ и СO₂. Для СO₂ константа Михаэлиса К_м ≈ 9 мкМ, для О₂ К_м ≈ 350 мкМ. В нашей атмосфере около 20% O₂ и только 0,04% СO₂, в воде, находящейся в равновесии с атмосферным воздухом при комнатной температуре, концентрации этих газов составляют -250 мкМ O₂ и -11 мкМ СO₂; такие концентрации способствуют «фиксации» O₂ с помощью рубиско и, следовательно, вызывает значительные затраты

энергии. Температурная зависимость относительной растворимости O₂ и СO₂ ([O₂] / [СO₂]) круто возрастает при высоких температурах. Кроме того, сродство рубиско к СO₂уменьшается с увеличением температуры, усиливая вероятность катализа расточительной оксигеназной реакции. А так как СO₂ потребляется в реакциях ассимиляции, соотношение между O₂ и СO₂ в воздушном пространстве, которое окружает листья, увеличивается, что еще больше способствует оксигеназной реакции.

Рис. 20-20. Оисигеназная активность рубиско. Рубиско может включать O₂ вместо СO₂ в рибулозо-1,5-бисфосфат. Образующийся нестабильный интермедиат распадается на 2-фосфогликолат (он перерабатывается, как показано на рис. 20-21) и 3-фосфоглицерат, который может включаться в цикл Кальвина.

Усвоение фосфоглицерата обходится клетке весьма дорого

Гликолатный путь осуществляет превращение двух молекул 2-фосфогликолата в молекулу серина (3 атома углерода) и молекулу СO₂ (рис. 20-21). В хлоропласте фосфатаза переводит 2-фосфогликолат в гликолат, который экспортируется в пероксисому. Там гликолат окисляется молекулярным кислородом, и получившийся альдегид (глиоксилат) подвергается трансаминированию с образованием глицина. В качестве побочного продукта реакции окисления гликолата образуется пероксид водорода, который распадается под действием пероксидазы пероксисомы. Глицин транспортируется из пероксисомы в митохондрию, где подвергается окислительному декарбоксилированию под действием глициндекарбоксилазного комплекса. Этот фермент похож по структуре и механизму действия на митохондриальные ферменты, с которыми мы уже сталкивались: пируватдегидрогеназный и α-кетоглутаратдегидрогеназный комплексы (гл. 16). Глициндекарбоксилазный комплекс окисляет глицин до СO₂ и NН₃ с одновременным восстановлением NАD+ до NАDН и переносом оставшегося атома углерода от глицина на кофактор тетрагидрофолат (рис. 20-22). Получившаяся одноуглеродная единица затем переносится серин-гидроксиметилтрансферазой, синтезирующей серин, с тетрагидрофолата на второй глицин. Итоговая реакция, катализируемая глициндекарбоксилазным комплексом и серин- гидроксиметилтрансферазой приведена ниже.

2 Глицин + NАD⁺ + Н₂O —> серин + СO₂ + NН₃ + NАDН + Н⁺

Затем серин превращается в гидроксипируват, далее в глицерат и в конце концов в 3-фосфо- глицерат, который используется для регенерации рибулозо-1,5-бисфосфата, завершая этот длинный «дорогой» цикл (рис. 20-21).

Рис. 20-21. Гликолатный путь. Путь усвоения 2-фос- фоглицерата (выделен розовым) через его превращение в серин и в конечном счете в 3-фосфоглицерат, в котором участвуют три компартмента клетки. Гликолат, образующийся при дефосфорилировании 2-фосфогликолата в хлоропластах, окисляется в пероксисомах до глиоксилата и затем трансаминируется до глицина. В митохондриях две молекулы глицина конденсируются с образованием серина, и СO₂ высвобождается в процессе фотодыхания (выделен зеленым). Эта реакция катализируется глициндекарбоксилазой, ферментом, присутствующим в высоких концентрациях в митохондриях С₃-растений (см. текст). Серин превращается в гидроксипируват и затем в глицерат в пероксисомах; глицерат попадает в хлоропласты, фосфорилируется и включается в цикл Кальвина. Кислород (окрашен голубым) потребляется в процессе фотодыхания в две стадии.

При ярком солнечном свете утечка через гликолатный путь может быть очень высокой. Растение производит таким способом в 5 раз больше СO₂, чем обычно образуется в результате всех окислительных реакций в цикле трикарбоновых кислот. Для обеспечения этого потока митохондрии растений содержат потрясающе огромное количество глициндекарбоксилазного комплекса: в листьях гороха и шпината четыре белка этого комплекса составляют половину всех белков митохондриального матрикса! В нефотосинтезирующих частях растения, таких как картофельные клубни, митохондрии содержат глициндекарбоксилазный комплекс в очень низкой концентрации.

Совместная активность рубиско-оксигеназы и гликолатного пути потребляет O₂ и производит СO₂ — откуда и название фотодыхание. Возможно, этот путь лучше назвать цикл фотосинтетического окисления углерода или С₂-путь; эти названия не вызывают ассоциации с дыханием в митохондрии. В отличие от митохондриального дыхания фотодыхание не сохраняет энергию и может ингибировать образование чистой биомассы почти на 50%. Эта неэффективность ведет к эволюционным адаптациям, особенно у растений, которые развиваются в теплом климате.

У С₄-растений фиксация СO₂ и активность рубиско пространственно разделены

У многих растений, которые растут в тропиках, а также теплолюбивых культур, происходящих из тропиков, таких как кукуруза, сахарный тростник и сорго, развился механизм, благодаря которому они избегают проблемы невыгодного фотодыхания. Стадии включения СO₂ в трехуглеродный 3-фосфоглицерат предшествует несколько стадий, в том числе временная фиксация СO₂ в четырехуглеродное соединение. Растения, использующие этот путь, называются С₄-растениями, а сам процесс ассимиляции — С₄-метаболизмом, или С₄- путем. Растения, которые фиксируют СO₂ по пути, где на первой стадии происходит реакция конденсация СO₂ с рибулозо-1,5-бисфосфатом с образованием 3-фосфоглицерата, называются С₃-растениями.

С₄-Растения обычно развиваются при большой интенсивности света и высокой температуре. Их отличает несколько важных характеристик: высокая скорость фотосинтеза, большая скорость роста, низкий уровень фотодыхания, малая скорость потери влаги и специализированная структура листа. В листьях С₄-растений в фотосинтезе участвуют два типа клеток: мезофилл и клетки обкладки (рис. 20-23, а). Существуют три варианта С₄-метаболизма, расшифрованные в 1960-х гг. Маршаллом Хэтчем и Роджером Слэком (рис. 20-23, б).

Рис. 20-22. Глициндекарбоксилазная система. Глициндекарбоксилаза митохондрий растений представляет собой комплекс из четырех типов субъединиц со стехиометрией P₄H₂₇T9L₂. С белком Н ковалентно связан остаток липоевой кислоты, которая может подвергаться обратимому окислению. (1) — образование шиффова основания между пиридоксальфосфатом (PLP от англ. pyridoxal phosphate) и глицином, катализируемое белком Р (названным так потому, что он образует связь с PLP). (2) — белок Р катализирует окислительное декарбоксилирование глицина, высвобождая СО₂; оставшаяся группа метиламина связана с одной из -SH-групп восстановленной липоевой кислоты. (3) — белок Т (который использует тетрагидрофолат (H₄F) в качестве кофактора) высвобождает NH₃ из метиламина и переносит оставшийся одноуглеродный фрагмент на тетрагидрофолат, образуя N^{5, N10}-метилентетрагидрофолат. (4) — белок L окисляет две -SH- группы липоевой кислоты до дисульфидной связи, (5) передавая электроны через FAD на NAD⁺ и завершая таким образом цикл. N⁵, N¹⁰-Метилентетрагидрофолат, образованный в этом процессе, используется серин-гидроксиметилтрансферазой для превращения молекулы глицина в серин, в результате регенерируется тетрагидрофолат, необходимый для реакции, катализируемой белком Т. L-Субъединица глициндекарбоксилазы идентична дигидролипоилдегидрогеназе (Е₃) пируватдегидрогеназы и α-кетоглутаратдегидрогеназы (см. рис. 16-6).

У тропических растений первый интермедиат, в который включается ¹⁴СО₂, — четырехуглеродное соединение оксалоацетат. Эта реакция происходит в цитозоле клеток мезофилла листьев и катализируется фосфоенолпируват- карбоксилазой, субстратом для которой служит НСО₃^-, а не СО₂. Затем оксалоацетат либо восстанавливается до малата с расходом NADPH (см. рис. 20-26, б), либо превращается в аспартат в реакции трансаминирования:

Оксалоацетат + α-аминокислота —> L-аспартат + α-кетокислота

Малат или аспартат, синтезированный в клетках мезофилла, проникает в соседние клетки обкладки через плазмодесмы — образованные белками каналы, которые соединяют две растительные клетки и осуществляют движение метаболитов и даже малых белков между клетками. В клетках обкладки малат окисляется и декарбоксил ируется с образованием пирувата и СО₂ под действием NADP-зависимой декарбоксилирующей малатдегидрогеназы (иногда называемой малик-ферментом, или яблочным ферментом) с восстановлением NADP⁺. У растений, использующих аспартат в качестве переносчика СО₂, аспартат, поступивший в клетки обкладки, трансаминируется с образованием оксалоацетата и восстанавливается до малата, после чего СО₂ высвобождается малатдегидро- геназой или ФЕП-карбоксикиназой. Как показали эксперименты с образцами, меченными ¹⁴С, молекула СО₂, высвобождающаяся в клетках обкладки, — это та же самая молекула СО₂, которая изначально находилась в оксалоаце- тате в клетках мезофилла. Эта молекула СО₂ снова фиксируется, теперь с помощью рубиско, в той же самой реакции, которая происходит у С₃-растениях: происходит включение СО₂в положение С-1 молекулы 3-фосфоглицерата.

Пируват, образовавшийся при декарбокси- лировании малата в клетках обкладки, транспортируется обратно, в клетки мезофилла, где превращается в фосфоенолпируват в необычной реакции, катализируемой пируват-фосфатдикиназой (рис. 20-23, б). Этот фермент называется дикиназой, потому что он, используя одну молекулу АТР, одновременно фосфорилирует две разные молекулы: пируват до фосфоенолпирувата и фосфат до пирофосфата. Впоследствии пирофосфат гидролизуется до фосфата, поэтому получается, что для регенерации фосфоенолпирувата используются две высокоэнергетические фосфатные группы АТР. Теперь этот фосфоенолпируват готов для включения следующей молекулы СО₂ в клетки мезофилла.

Рис. 20-23. Ассимиляция углерода у С₄-растений. В растениях тропических районов преобладает С₄-путъ, проходящий в клетках мезофилла и клетках обкладки, а — электронная микрофотография, показывающая хлоропласта мезофилла и прилегающих клеток обкладки. Клетки обкладки содержат гранулы крахмала. Видны плазмодесмы, соединяющие две клетки. б — С₄-путь ассимиляции СO₂, который происходит с участием четырехуглеродного интермедиата.

ФЕП-карбоксилаза имеет высокое сродство к НСО_3- (который в водном окружении образуется из СО₂) и фиксирует СО₂ более эффективно, чем рубиско. В отличие от рубиско этот фермент не использует О₂ в качестве альтернативного субстрата, поэтому в этой реакции нет конкуренции между СО₂ и О₂. Таким образом, ФЕП- карбоксилазная реакция служит для фиксации СО₂ в форме малата. Высвобождением СО₂ из малата в клетках обкладки достигается высокая локальная концентрация углекислого газа для функционирования рубиско с почти максимальной скоростью и подавления ее оксигеназной активности.

В клетках обкладки СО₂ включается в 3-фосфоглицерат, поэтому другие реакции цикла Кальвина происходят так, как было описано ранее. Таким образом, у С₄-растений клетки мезофилла осуществляют ассимиляцию СО₂ по С₄- пути, а клетки обкладки синтезируют крахмал и сахарозу по С₃-пути.

В С₄-пути три фермента, которые регулируются светом, становятся более активными в дневное время суток. Малатдегидрогеназа активируется через тиоредоксин-зависимый восстановительный механизм, показанный на рис. 20-19; ФЕП-карбоксилаза активируется фосфорилированием серинового остатка; а пируват-фосфатдикиназа активируется дефосфорилированием. В последних двух случаях детали инициации светом процессов фосфорилирования или дефосфорилирования неизвестны.

У С₄-растений путь ассимиляции СО₂ энергетически более дорогой, чем у С₃-растений. На каждую молекулу СО₂, ассимилированную в С₄- пути, должна регенерироваться молекула ФЕП с затратой двух высокоэнергетических фосфатных групп АТР. Таким образом, С₄-растениям необходимо пять молекул АТР на ассимиляцию одной молекулы СО₂, в то время как С₃-растениям надо только три молекулы АТР (девять АТР на один триозофосфат). Однако при увеличении температуры (и уменьшении сродства рубиско к СО₂, как было замечено ранее) достигаются условия (около 28-30 °С), при которых выгода устранения фотодыхания значительно превосходит энергетические траты. С₄-Растения (например, сорняк росичка кровяная) в течение лета обгоняет в росте большинство С₃-растений, что может подтвердить любой опытный садовод.

У CAM-растений фиксация СО₂ и активность рубиско разделены во времени

Суккулентные растения, такие как кактусы и ананас, которые в природе произрастают в очень жарком и очень засушливом климате, осуществляют другой вариант фотосинтетической фиксации СО₂, уменьшающий потери воды через устьица, через которые СО₂ и О₂ должны попадать в ткань листа. Вместо пространственного разделения процессов начального захвата СО₂ и его фиксации рубиско (как это делают С₄-растения) они разобщают эти процессы во времени. Ночью, когда воздух холоднее и более влажный, устьица открыты и пропускают СО₂, который затем фиксируется на оксалоацетате ФЕП-карбоксилазой. Оксалоацетат восстанавливается до малата и запасается в вакуолях с целью защиты ферментов цитозоля и пластид от низких значений pH, возникающих из-за диссоциации яблочной кислоты. В дневное время устьица закрыты, что предотвращает потерю воды, которая происходила бы из-за высоких дневных температур, и углерод, включенный ночью в малат, высвобождается NADP-зависимой малатдегидрогеназой в виде СО₂. Этот СО₂ далее вовлекается ферментом рубиско в цикл Кальвина. Так как этот метод фиксации СО₂ впервые был открыт в многолетних толстянковых растениях из семейства Crassulaceae, он был назван crassulacean add metabolism (CAM-метаболизм), а соответствующие растения названы САМ-растениями.

Краткое содержание раздела 20.2 Фотодыхание, С₄- и САМ-пути

■ Когда рубиско использует в качестве субстрата О₂, а не СО₂, образующийся 2-фосфогликолат распадается по кислород-зависимому пути. В результате увеличивается расход О₂ — фотодыхание, или, более правильно, цикл фотосинтетического окисления углерода или С₂-путь. 2-Фосфогликолат превращается в глиоксилат, затем в глицин, а после этого в серин под действием ферментов стромы хлоропластов, пероксисом и митохондрий.

■ У С₄-растений путь ассимиляции углерода сводит к минимуму возможность фотодыхания: в клетках мезофилла СО₂ включается в четырехуглеродное соединение, которое попадает в клетки обкладки и высвобождает СО₂ в высоких концентрациях. Свободный СО₂ фиксируется рубиско и другие реакции цикла Кальвина происходят так же, как и у С₃-растений.

■ У CAM-растений в темноте СО₂ соединяется с малатом и хранится в вакуолях до наступления дня, когда устьица закрыты (для уменьшения потери влаги), и малат становится источником СО₂ для рубиско.