Основы биохимии Том 3 - А. Ленинджер 1985

Молекулярные механизмы передачи генетической информации
Репликация и транскрипция ДНК
Краткое содержание главы

ДНК Е. coli реплицируется полуконсервативным способом, так что каждая дочерняя двойная спираль состоит из одной родительской и одной новообразованной цепи. Кольцевая бактериальная хромосома реплицируется в двух направлениях из одной и той же точки начала репликации. Некоторые вирусные ДНК реплицируются по механизму “катящегося кольца”.

ДНК-полимераза I Е. coli катализирует синтез ДНК из четырех дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфатов в присутствии ионов Mg²⁺ с высвобождением в ходе реакции пирофосфата. Цепь растет в направлении 5'→3'. Для протекания реакции необходимо наличие предсуществующей цепи ДНК, которая служит одновременно и матрицей, и затравкой. Фермент синтезирует цепь ДНК, комплементарную цепи-матрице; полярность новообразованной цепи противоположна полярности матрицы. Клетки Е. coli содержат три ДНК-полимеразы. Главный фермент репликации - это ДНК-полимераза III, а ДНК-полимераза I выполняет при репликации вспомогательную функцию. Одна цепь ДНК (ведущая) реплицируется непрерывным образом в направлении 5'→3', другая же цепь (отстающая) реплицируется с образованием коротких фрагментов, называемых фрагментами Оказаки. Эти фрагменты, длина которых у прокариот может достигать 2000 нуклеотидов, синтезируются в направлении, противоположном направлению движения репликативной вилки. Образование каждого фрагмента Оказаки начинается с катализируемого примазой синтеза короткого комплементарного участка РНК, который играет роль затравки. Затем на 3'-конце этой РНК-затравки с помощью ДНК-полимеразы III синтезируется ДНК. После этого РНК-затравка вырезается и замещается комплементарной ДНК, которая затем сшивается с отстающей цепью при помощи ДНК-лигазы. Для репликации необходимы также хеликаза и ДНК-связывающие белки, которые расплетают матрицу и удерживают цепи ДНК в разведенном состоянии, помогая ДНК-полимеразе начать работу. Кроме того, расплетанию цепей способствует вращение молекулы ДНК, осуществляемое ДНК-гиразой. После репликации ДНК-гираза необходима также для образования сверхспиральных молекул ДНК. ДНК-полимераза I обладает как 3'→5'-, так и 5'→3'-экзонуклеазной активностью. Первая из них служит для исправления ошибок - с ее помощью выщепляются неспаренные нуклеотиды, тогда как вторая активность обеспечивает удаление РНК-затравок из фрагментов Оказаки и репарацию ДНК. ДНК-полимераза III тоже обладает этими экзонуклеазными активностями.

Процесс транскрипции катализируется ДНК-зависимой РНК-полимеразой - сложным ферментом, который синтезирует из рибонуклеозид-5'-трифосфатов цепь РНК, комплементарную одной из цепей двухцепочечной ДНК. Для узнавания промоторной области ДНК, т. е. сигнала инициации синтеза РНК, прокариотической РНК-полимеразе необходима особая субъединица о (сигма). С одного гена одновременно может транскрибироваться много цепей РНК. рРНК и тРНК образуются из более длинных РНК-предшественников, которые укорачиваются с помощью нуклеаз и далее ферментативным путем модифицируются, превращаясь в зрелые молекулы. Эукариотические мРНК образуются из предшественников большего размера, которые известны под названием гетерогенных ядерных РНК (гяРНК). Впоследствии они модифицируются путем присоединения длинного poly (А)-хвоста к 3'-концу и остатка метилгуанозина (“кэпа”) к 5'-концу. Интроны удаляются с помощью малых ядерных РНК (мяРНК).

В животных клетках, зараженных онкогенными РНК-содержащими вирусами, образуются РНК-зависимые ДНК-полимеразы, называемые также обратными транскриптазами. Эти ферменты транскрибируют вирусную РНК-хромосому с образованием комплементарной ДНК. Таким путем гены, обусловливающие рак (онкогены), могут включаться в геном животных клеток.

В бактериальных клетках, зараженных некоторыми РНК-содержащими вирусами, были найдены РНК-зависимые РНК-репликазы. Они обладают специфичностью по отношению к вирусной РНК-матрице. Выделенная из бактерий полинуклеотидфосфорилаза может обратимо синтезировать РНК-подобные полимеры из рибонуклеозид-5'-дифосфатов. Хотя этот фермент способен добавлять рибонуклеотиды к 3'-гидроксильному концу полимера и удалять их оттуда, обычно он выполняет функцию деградации РНК.

ЛИТЕРАТУРА

Репликация

Alberts В., Sternglanz R. Recent Excitement in the DNA Replication Problem, Nature, 269, 655-661 (1977). Прекрасный обзор сложных проблем, касающихся репликации и сверх- спиральности молекул ДНК, а также расплетания и точности воспроизведения цепей ДНК.

Komberg A. Aspects of DNA Replication, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 43, 1-9 (1979). Обзор современного состояния проблемы репликации ДНК и постановка новых вопросов. Указанный том содержит множество ценных статей.

Komberg A. DNA Replication, Freeman, San Francisco, Calif., 1980. Самая последняя монография по репликации, ДНК, содержащая полный перечень ссылок по данной проблеме.

ДНК-лигаза

Lehman I.R. DNA Ligase: Structure,

Mechanism, Function, Science, 186, 790-797 (1974).

Транскрипция

Chamberlin M.J. RNA Polymerase: An Overview. In: Losick R. and Chamberlin M.J. (eds.), RNA Polymerase, pp. 17-67, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1976.

Miller O. L, Jr. The Visualization of Genes in Action, Sci. Am., 228, 34-42, March 1973.

Pederson T. Messenger RNA Biosynthesis and Nuclear Structure, Am. Sci., 69 (1), 76-84 (1981).

Обратная транскрипция

Temin Н. RNA-Directed DNA Synthesis, Sci. Am., 226, 24-33, January 1972.

Процессинг РНК

Abelson J. RNA Processing and the Intervening Sequence Problem, Annu. Rev. Biochem., 48, 1035-1069 (1979).

Вопросы и задачи

1. Выводы из эксперимента Мезельсона-Сталя. Результаты эксперимента Мезельсона-Сталя доказали, что репликация ДНК в Е. coli протекает по полуконсервативному механизму. Согласно так называемой “дисперсивной” модели, цепи родительской ДНК расщепляются при репликации на фрагменты произвольного размера, а затем соединяются с фрагментами новосин тезированной ДНК, образуя дочерние дуплексы, в которых обе цепи содержат в случайном порядке как родительскую (“тяжелую”), так и дочернюю (“легкую”) ДНК. Объясните, почему эксперимент Мезельсона-Сталя исключил эту модель.

2. Эксперимент Кэрнса.

а) Почему Кэрнс при изучении хода репликации ДНК использовал радиоактивный тимидин?

б) Можно ли было с тем же успехом использовать радиоактивный аденозин или гуанозин?

в) Покажите ферментативный путь, по которому радиоактивный тимидин включается в ДНК E.coli.

3. Число оборотов хромосомы Е. coli. Сколько оборотов вокруг своей оси должна совершить хромосома Е. coli при раскручивании в процессе репликации?

4. Время репликации у E.coli.

а) Исходя из данных, приведенных в этой главе, рассчитайте, сколько времени занимает репликация хромосомы E.coli при 37°С, если две репликативные вилки движутся из точки начала репликации?

б) При определенных условиях клетки Е. coli могут расти и делиться с интервалами в 20 мин. Объясните, каким образом это происходит?

5. Репликативные вилки в Е. coli и в клетках человека.

а) Какое время необходимо для репликации гена рибонуклеазы E.coli (104 аминокислотных остатка), если репликативная вилка движется со скоростью 750 пар оснований в секунду?

б) Репликативная вилка в клетке человека движется всего лишь в 10 раз медленнее, чем в E.coli. Какая дополнительная информация потребуется вам, чтобы рассчитать минимальную скорость репликации гена человека, кодирующего белок из 104 аминокислотных остатков?

6. Спаривание оснований при репликации и транскрипции.

а) Напишите нуклеотидную последовательность участка ДНК, синтезируемого ДНК-полимеразой, на указанной ниже матрице ДНК, имея в виду, что нуклеотидные последовательности принято писать в направлении 5'→3'.

(5) AGCTTGCAACGTTGCATTAG (3)

б) Теперь напишите нуклеотидную последовательность участка матричной РНК, транскрибируемой РНК-полимеразой при использовании в качестве матрицы новосинтезированной цепи ДНК, полученной в п. а) этой задачи.

7. Состав оснований транскрипта РНК. Цепь ДНК, содержащая 10⁵ нуклеотидных остатков в соотношении А-21%, G-29%, С-29% и Т-21%, реплицируется при помощи ДНК- полимеразы с образованием комплементарной цепи. Полученную двухцепочечную ДНК затем используют в качестве матрицы для РНК-полимеразы, которая транскрибирует новую цепь ДНК. В результате синтезируется РНК такого же размера, как матрица.

а) Определите нуклеотидный состав образующейся РНК.

б) Предположим, что РНК-полимераза остановилась, пройдя только 2000 остатков новой цепи ДНК. Каким будет нуклеотидный состав новой короткой РНК?

8. Нуклеотидный состав ДНК, синтезированных на одноцепочечных матрицах. Определите нуклеотидный состав ДНК, синтезированной на матрице, представляющей собой двухцепочечную кольцевую ДНК фага фХ174 (т. е. репликативную форму ДНК этого фага), если нуклеотидный состав одной из цепей таков: А-24,7%, G-24,1%, С-18,5% и Т-32,7%. Какое допущение необходимо сделать, чтобы решить эту задачу?

9. Гибридизация ДНК с мРНК. ДНК гибридизуется с мРНК, транскрибированными с этой ДНК. Как вы объясните тот факт, что со всеми известными мРНК может гибридизоваться не более 50% всей ДНК Е. colil

10. Фрагменты Оказаки.

а) Сколько приблизительно фрагментов Оказаки образуется при репликации хромосомы E.coli?

б) Какие факторы гарантируют сборку большого числа фрагментов Оказаки в новую ДНК в правильном порядке?

11. Ведущая и отстающая цепи. Составьте список предшественников и ферментов, необходимых для синтеза ведущей и отстающей цепей при репликации ДНК.

12. Точность репликации ДНК.

а) Какие факторы обеспечивают точность репликации в ходе синтеза ведущей цепи новой ДНК?

б) Можно ли ожидать, что отстающая цепь синтезируется с той же точностью, что и ведущая? Поясните ваш ответ.

13. Инициация репликации. ДНК-репликазная система для своего функционирования нуждается в матрице и затравке; более того, она не способна реплицировать интактную кольцевую ДНК, за исключением особых обстоятельств.

а) Каков биологический смысл этого свойства репликазной системы?

б) Каковы могут быть особые обстоятельства, при которых ДНК-репликазная система способна реплицировать интактную кольцевую ДНК?

14. Различия между РНК-полимеразой и полинуклеотидфосфорилазой. РНК-полимераза требует для транскрипции в качестве предшественников нуклеозид-5'-трифосфаты, а с нуклеозид-5'-дифосфатами она не работает. Полинуклеотидфосфорилаза, наоборот, требует нуклеозид-5'-дифосфаты, а с 5'-трифосфатами она не работает.

а) Какова причина указанных различий между этими двумя ферментами в требовании к предшественникам?

б) В связи с вашим ответом на вопрос п. “а” укажите, какие другие различия между данными ферментами имеют отношение к затронутому вопросу.

15. Исправление ошибок. ДНК-полимеразы могут выявлять и исправлять ошибки, тогда как РНК-полимеразы такой способностью, по-видимому, не обладают. Поскольку ошибка даже в одном основании как при репликации, так и при транскрипции может привести к ошибке в синтезе белка, можете ли вы дать биологическое объяснение этому поразительному различию?