Биохимия человека Том 2 - Марри Р. 1993

Структура, функция и репликация информационных макромолекул
Организация и репликация ДНК
Гистоны и нуклеосомы

Термином «гистоны» обозначают несколько групп близкородственных основных белков. Н1-гистоны наиболее слабо связаны с хроматином и легко отмываются в солевом растворе. После такой обработки хроматин становится растворимым. Изолированные ядра нуклеосом состоят из гистонов четырех классов: Н2А, Н2В, Н3 и Н4. Структура умеренно богатых лизином гистонов Н2А и Н2В характеризуется значительной консервативностью, еще более консервативна структура гистонов Н3 и Н4 (богатых аргинином). Высокая консервативность структуры гистонов свидетельствует об идентичности функций этих белков у всех эукариот. С-концевая часть их молекулы имеет обычный аминокислотный состав, тогда как N-концевая треть молекулы состоит преимущественно из основных аминокислот. Перечисленные выше четыре группы гистонов подвергаются ковалентной модификации пяти типов: ацетилированию, метилированию, фосфорилированию, ADP-рибозилированию и ковалентному связыванию (только Н2А) с убиквитином (ядерным белком). Эти модификации, вероятно, влияют на структуру и функции хроматина (пока данный вопрос изучен недостаточно).

Рис. 38.1. Электронная микрофотография нуклеосом, соединенных ДНК-цепью; белая полоса соответствует 2,5 мкм. (Reproduced with permission, from P. Oudet, M. Gross-Bellard, P. Chambon: Electron microscopic and biochemical evidence that chromatin structure is a repeating unit Cell 1975, 4: 281.)

Выделенные из хроматина гистоны взаимодействуют между собой. Гистоны Н3 и Н4 агрегируют с образованием тетрамеров, состоящих из двух молекул каждого типа (Н3₂-Н4₂). Гистоны Н2А и Н2В образуют либо димеры (Н2А-Н2В), либо олигомерные комплексы [Н2А-Н2В]_n. Тетрамер Н3₂-Н4₂ не взаимодействует с Н2А-Н2В-димером или олигомером. Гистоны Н1 не связываются в растворе с другими гистонами.

Интересно, что смесь Н3₂-Н4₂ и Н2А-Н2В с очищенной двухцепочечной ДНК дает картину рентгеновской дифракции, характерную для свежевыделенного хроматина. На электронно-микроскопических фотографиях такого препарата видны вновь образованные нуклеосомы. Более того, оказалось, что образование нуклеосом in vitro из ДНК и гистонов Н2А, Н2В, Н3 и Н4 не зависит от того, из каких организмов или клеток были выделены компоненты смеси. Гистоны Н1 и негистоновые белки для формирования нуклеосомного кора не требуются.

В нуклеосомах ДНК суперскручена на поверхности дисковидного гистонового октамера в левостороннюю спираль. Октамер состоит из центрального Н3₂-Н4₂-тетрамера и двух Н2А-Н2В-димеров (рис. 38.2). Гистоновая сердцевина нуклеосомы взаимодействует с внутренней поверхностью суперспирали и не выступает за ее пределы.

Тетрамер Н3₂-Н4₂ способен придавать ДНК нуклеосомоподобную структуру и, следовательно, играет центральную роль в ее формировании. Два добавочных димера Н2А-Н2В стабилизируют первичную частицу и прочно соединяют два полувитка ДНК, ранее слабо связанных с Н3₂-Н4₂-тетрамером. Таким образом, 1,75 супервитков ДНК закручиваются вокруг гистонового октамера и образуют нуклеосомный кор (или минимальную нуклеосому), который «маскирует» 146 пар оснований ДНК (рис. 38.2). ДНК по ходу спирали вокруг октамера контактирует с гистонами в следующем порядке:

Н2А-Н2В-Н4-Н3-Н3-Н4-Н2В-Н2А.

Рис. 38.2. Модель структуры нуклеосомы (слева) и нуклеосомного кора (справа), в которой ДНК закручена вокруг белкового цилиндра, содержащего по две молекулы каждого из гистонов Н2А, Н2В, Н3 и Н4. Гистон Н1 (заштрихованная область) расширяет область маскированных участков последовательности ДНК. (Reproduced, with permission, from Laskey R. A. and Eamshaw W.C.: Nucleosome assembly. Nature 1980, 286: 763.)

Гистон Н1 связывается с нуклеосомным кором на участке входа и выхода ДНК, «склеивая» 2 оборота, т.е. 166 пар оснований суперспирали ДНК. Так формируется зрелая нуклеосома.

В сборке нуклеосомы, вероятно, участвует ядерный белок анионного характера — нуклеоплазмин. Заметим, что гистоны, являясь сильными катионитами, могут неспецифически связаться с отрицательно заряженной ДНК с образованием солевых мостиков. Ясно, что такое неспецифическое взаимодействие может мешать образованию нуклеосом и проявлению функций хроматина. Нуклеоплазмин — это анионный пентамерный белок, не связывающийся ни с ДНК, ни с хроматином, но способный обратимо соединяться с гистоновым октамером, блокируя способность гистонов к неспецифическому «прилипанию» к отрицательно заряженным структурам, таким, как ДНК. По-виднмому, нуклеоплазмин создает в ядре специфическое ионное окружение, способствующее взаимодействию гистонов с ДНК и сборке нуклеосом. После завершения сборки нуклеоплазмин высвобождается из гистонового комплекса. Нуклеоплазмин проявляет избирательность к определенным областям ДНК. Молекулярная основа этого неслучайного распределения, названного фазированием, неизвестна. Возможно, оно связано с относительной физической пластичностью определенных нуклеотидных последовательностей, способных к скручиванию в суперспираль.

Упаковка нуклеосом в ядре, по-видимому, зависит от взаимодействия Н1 гистонов с участками двухцепочечной ДНК, соединяющими нуклеосомы. Топология этого взаимодействия, приводящего к образованию межнуклеосомных спейсерных участков, изучена недостаточно полно.

Электронная микроскопия хроматина кроме нуклеосом выявила еще две структуры высшего порядка — фибриллы диаметром 10 нм и волокна диаметром 25—30 нм. Дисковидные нуклеосомы (см. выше) имеют диаметр 10 нм и высоту 5 нм. По-видимому, фибриллы толщиной 10 нм состоят из ряда нуклеосом, касающихся друг друга своими краями и ориентированных плоскими поверхностями вдоль оси фибриллы (рис. 38.3). Вероятно, фибриллы тоже скручиваются в спираль, на виток которой приходится 6—7 нуклеосом. В результате образуется хроматиновое волокно диаметром 30 нм (рис. 38.4). Витки такой «суперспирали» должны быть достаточно плоскими, а плоские поверхности нуклеосом последующих витков — параллельными друг другу. Н1-гистоны, по всей вероятности, стабилизируют структуру волокна, но их расположение так же, как и длина спейсерных участков ДНК, точно не определены. Вероятно, нуклеосомы способны формировать еще ряд компактных суперструктур. Для того чтобы образовалась митотическая хромосома нормального размера, волокно диаметром 30 нм должно подвергнуться дополнительной компактизации с уменьшением результирующей длины еще в 100 раз (см. ниже).

В интерфазных хромосомах хроматиновые волокна организованы в домены или петли, состоящие из 30000—100000 пар оснований и «заякоренные» на внутриядерном поддерживающем матриксе. Распределение участков генома в рамках доменной структуры хроматина, вероятно, не является случайным. Можно предположить, что каждый петлеобразующий домен хроматина содержит как кодирующие, так и некодирующие области генов, соответствующих определенной генетической функции.

Рис. 38.3. Структура фибриллы хроматина диаметром в 10 нм, состоящей из дискообразных нуклеосом. Положение Н1-гистона не показано.

Рис. 38.4. Структура хроматинового волокна диаметром 30 нм, состоящего из суперскрученных фибрилл диаметром 10 нм. Ось волокна направлена перпендикулярно плоскости страницы.

Активный хроматин

Как правило, каждая клетка многоклеточного организма содержит одну и ту же генетическую информацию в виде одной и той же последовательности ДНК. Из этого следует, что различия между типами клеток данного организма должны объясняться дифференцированной экспрессией общей генетической информации. Хроматин, содержащий активные гены (транскрипционно-активный хроматин), отличается по некоторым признакам от неактивного. Нуклеосомная структура активного хроматина видоизменена или, в особо активных областях, вообще отсутствует. ДНК в активном хроматине содержит длинные участки (около 100000 пар оснований), чувствительные к действию нуклеаз (например, ДНКазы I). Чувствительность к ДНКазе I указывает на возможность транскрипции и в некоторых случаях коррелирует с отсутствием 5-метилдезок- сицитидина в соответствующей области ДНК.

Внутри большой области активного хроматина обнаружены короткие участки (100—300 нуклеотидов) с еще более высокой (на порядок) чувствительностью к ДНКазе I. Эти, так называемые гиперчувствительные сайты, по-видимому, возникают в результате конформационных изменений, которые создают особенно благоприятные условия для действия нуклеазы на ДНК. Такие участки обычно локализованы непосредственно перед активным геном и могут быть обусловлены наличием так называемых энхансерных элементов, усиливающих транскрипцию (см. гл. 39 и 41). Есть основания считать, что во многих случаях транскрипционная активность гена связана с наличием в хроматине гиперчувствительного к ДНКазе сайта, непосредственно прилегающего к началу гена. Вероятно, такие сайты обеспечивают доступность кодирующей цепи для белков, участвующих в процессе транскрипции.

Электронная микроскопия интерфазного ядра показывает, что транскрипционно-неактивный хроматин (гетерохроматин) плотно упакован, и потому соответствующие области интенсивно окрашиваются. Участки транскрипционно-активного хроматина (эухроматина) имеют более слабую окраску. В целом в ходе клеточного цикла млекопитающих (см. ниже) эухроматин реплицируется раньше, чем гетерохроматин.

Существуют два типа гетерохроматина: конститутивный гетерохроматин и факультативный гетерохроматин. Конститутивный гетерохроматин всегда конденсирован и, следовательно, неактивен. Конститутивный гетерохроматин найден в областях, близких к центромерам и концевым участкам (теломерам) хромосом. Факультативный гетерохроматин временами конденсирован, а временами разуплотнен, активно транскрибируется и таким образом оказывается сходным с эухроматином. Из двух X-хромосом самок млекопитающих — одна практически полностью транскрипционно-неактивна, т. е. проявляет свойства гетерохроматина. Однако при гаметогенезе и на ранних стадиях эмбриогенеза гетерохроматиновая Х-хромосома становится транскрипционно-активной и, следовательно, проявляет свойства факультативного гетерохроматина.

Некоторые клетки насекомых, например Chironomus, содержат гигантские хромосомы, образовавшиеся в результате нерасхождения дочерних хроматид после прохождения ~ 10 циклов репликации. Копии ДНК, лежащие рядом в точном соответствии с локализованными на них генами, образуют хромосому с четко выраженным распределением полос — конденсированного и менее плотного хроматина.

Транскрипционно-активные области таких политенных хромосом отличаются особенно отчетливой разуплотненностью — они образуют так называемые «пуфы», в которых, как установлено, локализуются ферменты системы транскрипции и происходит синтез РНК (рис. 38.5).

Хромосомы

В метафазе хромосомы млекопитающих обладают двулучевой симметрией второго порядка и состоят из идентичных сестринских хроматид, соединенных в центромере, положение которой характерно для каждой хромосомы (рис. 38.6). Каждая сестринская хроматида содержит одну двухцепочечную молекулу ДНК. В интерфазе упаковка молекулы ДНК менее плотная, чем в метафазе. Метафазные хромосомы транскрипционно-неактивны.

Гаплоидный геном человека состоит из 3,5∙10⁹ пар оснований и примерно из 1,7∙10⁷ нуклеосом. Следовательно, каждая из 23 хроматид гаплоидного генома человека содержит в среднем 1,5∙10⁸ нуклеотидов в одной двухцепочечной молекуле ДНК. Таким образом, при формировании конденсированной метафазной хромосомы линейный размер каждой молекулы ДНК должен быть уменьшен в 8000 раз! В метафазных хромосомах хроматиновые волокна (длиной 25—30 нм) также складываются в серии петлеобразных доменов, проксимальные участки которых закрепляются на внутриядерном белковом (негистоновом) каркасе. Коэффициенты, характеризующие плотность упаковки каждой упорядоченной структуры ДНК, приведены в табл. 38.1.

Рис. 38.5. Корреляция между активностью РНК-полимеразы II и синтезом РНК. При тепловом шоке (39° С, 30 мин) личинок Chironomus tentans активируется ряд генов. А. Распределение РНК-полимеразы В (тип ІІ) по длине четвертой хромосомы из клеток слюнных желез. Фермент выявляли иммунофлуоресцентным методом, используя антитела против полимеразы. 5С и BR3 — специфические сегменты IV хромосомы. Стрелками указаны пуфы. Б. Радиоавтограф IV хромосомы, инкубированной с Н³-уридином для введения метки в РНК. Распределение иммунофлуоресцентных сигналов и радиоавтографических пятен по хромосоме совпадает. (Reproduced, with permission, from Sass H. PNA polymerase В in polytene chromosomes. Cell 1982: 28: 274. Copyright 1982 by the Massachusetts Institute of Technology.)

Упаковка нуклеопротеинов в хроматиды происходит неслучайным образом, о чем свидетельствует характерное расположение полос на хромосомах, окрашенных акрихин-ипритом или по Гимза (рис. 38.7).

Таблица 38.1. Коэффициенты упаковки для различных типов суперструктурированной ДНК

Распределение окрашенных полос (бендов) в хромосомах хорошо воспроизводится в препаратах разных индивидуумов одного вида, но сильно различается у хромосом разных, даже близкородственных, видов. Следовательно, упаковка нуклеопротеинов в хромосомы у высших эукариот должна определенным образом зависеть от видоспецифических особенностей структуры самих молекул ДНК.