Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022

Методы экспериментального исследования структуры белков
Хроматография
Метод бумажной хроматографии

Один из первых методов хроматографии примененной на практике - метод бумажной хроматографии (БХ). В нем неподвижной фазой служит лист фильтровальной или хроматографической бумаги. Вначале бумага увлажняется парами растворителя, что превращает ее в пригодную для хроматографирования стационарную фазу.

В биохимических исследованиях растворителем служит, как правило, вода. Элюэнт - водно-органическая смесь совмещающихся между собой жидкостей (например, н-бутанол-вода; этилацетат-вода; бутанол-укс.к-та-вода; пиридин-укс.к-та-бутанол-вода; фенол-вода и др. в различных объемных соотношениях). Элюэнт перемещается по бумаге под действием капиллярных сил.

На практике применяют восходящую, нисходящую и радиальную БХ.

Восходящая и нисходящая БХ. Опыты проводят так. На небольшом расстоянии от конца (место старта) подготовленного для БХ листа бумаги наносят каплю или узкую полоску (капиляром) анализируемого образца. Этот лист помещают в герметически закрытый сосуд (стакан) с насыщенными парами элюэнта так, чтобы точка старта была над поверхностью растворителя. Элюэнт, двигаясь по бумаге увлекает за собой компоненты анализируемого образца. Неподвижной фазой в БХ является фактически вода (полярное вещество). Подвижная фаза менее полярна из-за наличия в ней органического растворителя.

Это приводит к тому, что компоненты смеси образца по разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами и, как результат, движутся по бумаге с различной скоростью вслед за фронтом элюэнта. Соединения, имеющие большую растворимость в воде движутся медленнее, т.е. удерживаются неподвижной фазой сильнее тех, которые имеют большее сродство к водноорганическому растворителю. Подвижность соединения в бумажной хроматографии принято выражать величиной R_f.

Оба расстояния при вычислении R_f отсчитываются от точки старта.

При анализе многокомпонентных смесей часто прибегают к двухмерной БХ. Образец наносят в угол бумаги и пропускают элюэнт вначале в одном направлении. Высушивают хроматограмму. Затем проводят хроматографирование этим же или другим элюэнтом в направлении перпендикулярном первому.

Радиальная БХ

Кроме нисходящей и восходящей используется еще и вариант радиальной БХ. Смысл радиальной БХ ясен из приведенного рисунка.