Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022

Методы экспериментального исследования структуры белков
Электронная микроскопия
Подготовка и “окрашивание” образцов - Молекулярная электронная микроскопия

Техника трехмерной электронной микроскопии “окрашенных” образцов может быть применена для исследования и неокрашенных объектов с более высоким разрешением. Теоретически такой подход предполагает возможность прямого визуального наблюдения образующих молекулу атомов. Попытки выполнения таких экспериментов предпринимались. Однако, результаты пока не удовлетворительны, а трудности весьма велики. Связаны они прежде всего с тем, что образец нужно предохранить от дегидратации, которая в условиях глубокого вакуума в рабочей камере электронного микроскопа наступает очень быстро. Решают эту проблему заливкой образца в тонкую пленку сахарозы. Во-вторых, “неокрашенный” образец не защищен от прямого радиационного разрушения, избежать которого можно только путем значительного сокращения времени пребывания объекта в зоне электронного луча (время экспозиции). Практически, образец может выдержать только непродолжительный импульс, т.е. получаемое изображение имеет чрезвычайно низкую контрастность. Поэтому, информация о структуре может быть получена только для высокоупорядоченных двухмерных кристаллов.

В случае “неокрашенных” тяжелыми металлами образцов объект (белок) состоит из легких атомов. Как результат, его изображение формируется не в результате поглощения электронов, а за счет их торможения. Последнее изменяет только фазу электронной волны. Поэтому, единичное точно сфокусированное изображение “неокрашенных” объектов не содержит информации и структуре. Для получения такой информации необходимо сделать серию снимков с различной фокусировкой (на различной, грубо говоря, глубине объекта). Обработкой с помощью ЭВМ этих снимков можно выйти на фазово-контрастное изображение и реконструировать объемную трехмерную структуру.

Микроскоп Крева. В обычном электронном микроскопе падающий пучок электронов покрывает весь образец. Существует несколько типов взаимодействия электронов с образцом:

1) отсутствие взаимодействия (т. е. прохождение через межатомные пространства) - наиболее распространено;

2) упругое рассеяние (без потери энергии) орбитальными электронами атомов образца - также встречается достаточно часто;

3) неупругое рассеяние (с потерей энергии) ядрами атомов - встречается реже.

Соотношение последних двух видов взаимодействия является характеристическим для каждого элемента, так как для каждого характерен определенный размер ядерной мишени и для более тяжелых элементов, следовательно, увеличивается доля неупругого рассеяния.

Исходя из этого был разработан новый специальный тип микроскопа. В нем пучок электронов сжимается до очень малого (приблизительно 5 Å) пятна. Это пятно быстро обегает образец, подобно тому как это делает электронный луч развертки изображения на экране телевизора. При движении пучка измеряется соотношение интенсивности электронов двух последних видов в каждой точке с помощью спектрометра энергии электронов. Полученное соотношение преобразуется в изображение на телевизионном экране соответствующим электронным устройством. Это новый важный шаг вперед в электронной микроскопии, дающий новый элемент анализа, поскольку здесь возможна идентификации индивидуальных атомов. В некоторых случаях предельное разрешение удается довести до 2 Å.

Сканирующий микроскоп обратного рассеяния. Сканирующий электронный микроскоп представляет собой прибор, который позволил получить множество прекрасных микрофотографий клеточных поверхностей. Разрешение микроскопа ограничено 200 Å, причем он работает по совершенно другому принципу по сравнению с обычным электронным микроскопом.

Подобно микроскопу Крева, пучок здесь сжимается в маленькое (100 Å) пятно, которое обегает поверхность образца, покрытого толстым (200 Å) слоем золота или другого тяжелого металла. Когда пучок падает на металл и проходит в нем короткое расстояние, золото начинает испускать электроны вследствие вторичной эмиссии или электроны пучка за счет обратного рассеяния. Это позволяет формировать объемные картины исследуемых поверхностей клеток (см. рис. 4.18).

Рис. 4.18 Электронная микрофотография эритроцитов человека, полученная Томасом Хайесом с помощью сканирующего электронного микроскопа