Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022

Методы экспериментального исследования структуры белков
Рентгеноструктурный анализ
Проблема начальных фаз в РСА

Прежде, чем перейти к рассмотрению фазовой проблемы РСА введем понятие элементарной ячейки кристаллической решетки. Элементарная ячейка есть минимальный структурный элемент кристаллической решетки, отражающий все ее геометрические характеристики. Это шесть скалярных параметров (величины длин ребер и углов между ними) или три единичных вектора, в направлениях осей X,Y,Z (не всегда, кстати, ортогональных). Вся бесконечная трехмерная кристаллическая решетка есть, следовательно, повторение в пространстве ее элементарной ячейки (см. рис.) В случае белковых молекул элементарную ячейку представляют как объем пространства, занятого одной или более молекулами белка (см. рис 4.20. для миоглобина).

Рис 4.20 Упаковка двух молекул миоглобина в элементарной ячейке кристаллической решетки. Черные пластинки — группы гема.

Конечной целью кристаллографического исследования является установление распределения электронной плотности в трехмерной элементарной ячейке кристалла p(x,y,z). Обычно считают, что электронная плотность в ячейке распределена непрерывно и имеет максимумы в центрах тяжести, находящихся в ячейке атомов. Эта плотность является периодически повторяющейся функцией при переходе из ячейки в ячейку. В трехмерном пространстве она выражается через преобразование Фурье, которое имеет вид не интеграла, а тройного ряда Фурье:

где F(hkl)- амплитуды, D(hkl)- начальные фазы лучей.

Амплитуды легко определяются экспериментально по интенсивности дифракционных максимумов (интенсивность пропорциональна квадрату амплитуды световой волны), а начальные фазы остаются неизвестными. Приемы определения начальных фаз в кристаллографии белков и кристаллографии малых молекул различны.

Проблема начальных фаз на разных этапах становления метода РСА небольших молекул выглядела примерно так. Первый этап - до 1935г. Это период метода “проб и ошибок”, когда модель размещения атомов по ячейке кристалла фактически подгонялась под экспериментальную дифракционную картину без всяких попыток решения фазовой задачи. При построении таких моделей исходили из определенных предположений о трехмерной структуре кристалла, вытекающих из каких-либо косвенных физико-химических данных.

Второй этап - с 1935 г., когда Паттерсон предложил первый прямой метод анализа структуры на основании экспериментальных данных по распределению дифракционных пятен. Этот метод позволял однозначно определять координаты входящих в кристалл тяжелых атомов, а вся остальная структура кристалла следовала как привязка к этим тяжелым атомам.

В 1952г три автора - Захариазен, Кокрен и Сейр независимо и одновременно разработали и предложили принципиально новый статистический подход к решению фазовой проблемы, не требующий присутствия в кристалле тяжелых атомов.

Ни один из этих методов, однако, неприемлем для анализа таких сложных молекулярных образований как белки.