Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022

Введение

Основные этапы становления химии белка

Впервые, в числе объектов химических исследований белок оказался в начале 18 столетия. В 1728 году итальянский ученый Я. Беккари выделил из пшеничной муки клейковину и исследовал продукты ее сухой перегонке. В 1745 году он опубликовал результаты своих исследований, и это была первая научная публикация о белке. Позже были выделены белковые вещества растительного и животного происхождения, установлена близость их химических свойств.

Первые элементные анализы белков растительного происхождения выполнили Ж. Гей-Люссак и Л. Тенар в 1810 г. Результаты этих анализов для различных белков оказались весьма близкими. На основании чего были предложены первые эмпирические структурные формулы белков и высказаны некоторые гипотезы относительно их состава. В 1841 г. немецкий химик Ю.Либих предположил, что белки растительного и животного происхождения близки по своему составу. Несколько раньше (в 1836 г.) голландец Г. Мульдер высказал мнение, что в составе всех белков содержится один и тот же радикал (фрагмент), который он назвал протеином (от греческого “первенствую”). Этот радикал (Pr), по Мульдеру, имел следующий состав Pr = C₄₀H₆₂N₁₀O₁₂. Это, пожалуй все, что дали накопленные эмпирические данные об элементном составе белковых веществ. Они не позволили выявить ни структуру белков, ни зависимость между их строением и свойствами. Не смогла разрешить эту задачу и теория протеина. Более того, проверка данных Мульдера Н. Лясковским, Ю. Либихом и его учениками завершилась заключением, что никакого белкового радикала не существует.

К середине 19 века были разработаны многочисленные приемы выделения и очистки белков путем осаждения их из растворов солей.

Используя эти методики, Т. Шванн выделил в 1836 г. пепсин, К. Рейхерт в 1847 г. впервые получил кристаллы гемоглобина, Л. Корвизар в 1856 г. открыл трипсин. Дальнейшее развитие этих исследований привело к установлению того факта, что некоторые белки обладают способностью расщеплять белковые молекулы. Они были названы протеолитическими ферментами или протеазами. Белковые фрагменты, образующиеся под действием протеаз, получили название пептонов. При анализе смесей пептонов в их составе были обнаружены известные уже с начала 19 века аминокислоты. Этот факт и был, вероятно, отправной точкой гипотезы об аминокислотном составе белков.

Истоки химии аминокислот

Становление химии аминокислот связано, в основном, со следующими открытиями.

> В 1806 г. было открыто первое производное аминокислот - амид аспарагина.

> В 1810 г. открыта первая аминокислота - цистин. Она была выделена из мочевых камней, т.е. вещества небелковой природы.

> В 1820 г. французский химик А. Браконно впервые выполнив кислотный гидролиз белка, выделил из гидролизата неизвестную аминокислоту, которую назвал глицином.

> Наличие в составе белков лейцина было доказано в 1839 г. В 1849 г. Ф. Бопп открыл в составе белка еще одну аминокислоту - тирозин.

Таким образом, к началу 40-х годов 19 в. было известно только 4 аминокислоты и один амид аминокислоты. Тем не менее, эти факты подтолкнули к мысли о наличии в природе особого класса органических соединений - аминокислот. И уже в 1850 г. А. Штреккер синтезировал в лаборатории аланин.

К концу 80-х гг. 19 в. из гидролизатов белков было выделено девять различных аминокислот, что явно свидетельствовало о наличии этих соединений в составе белков. К концу 19 в. число открытых аминокислот достигло 13, однако они оставались в глазах исследователей только обязательными, но не главными компонентами белковых молекул. Значительно большее значение, как структурным элементам белка, отводилось более сложным и менее определенным по строению пептонам. Кратко история открытия аминокислот отражена в таблице.

Таблица Хронология открытий аминокислот в составе белков*

- цит. по: В.Т.Иванов, А.Н.Шамин Путь к синтезу белка.- Л.: Химия, 1982.

Пептидная гипотеза строения белков

Предположения о полимерном строении молекул белков были высказаны Р. Хертом и А. Данилевским уже в 70-80 гг. 19 века. Однако, в основе этих идей остались представления о том, что “мономерами” в этих природных полимерах являются сложные образования. Данилевский, опираясь на результаты исследований биуретовой реакции, пришел к заключению о наличии в составе белковой молекулы цепочек перемежающихся атомов азота и углерода (R’-NH-CO-NH-CO-R”) и назвал их углеазотными комплексами. Небиуретовыми структурами в белках по Данилевскому являлись присоединенные к углеазотным комплексам аминокислоты.

Дальше, в признании важной роли аминокислот в строении белков, пошел немецкий физиолог и биохимик А. Коссель. Изучая протамины и гистоны, он нашел, что при их гидролизе образуются большие количества аргинина. Кроме того, в гидролизате он открыл ранее неизвестную аминокислоту гистидин. Исходя из этих данных Коссель считал, что основными составляющими белков являются аминокислоты. Однако в предлагаемых им структурных формулах белок еще не представлялся в виде пептидной цепи.

Отталкиваясь от Косселя немецкий химик Зигфрид в 1903 году высказал гипотезу о том, что основу белковой молекулы составляют комплексы построенные из нескольких аминокислот. Прежде всего - аргинина, лизина, глутаминовой кислоты. Эта гипотеза не успела найти широкого распространения, поскольку выдающийся немецкий химик Э. Фишер в это время уже активно разрабатывал пептидную теорию строения белка.

ФИШЕР (Fischer), Эмиль

9 октября 1852 г. - 15 июля 1919 г.

Нобелевская премия по химии, 1902 г.

Немецкий химик-органик Герман Эмиль Фишер родился в Ойскирхене, маленьком городке вблизи Кельна, в семье Лоренца Фишера, преуспевающего коммерсанта, и Юлии Фишер (в девичестве Пенсген). Весной 1871 г. отец направил его в Боннский университет. Здесь он посещал лекции известного химика Фридриха Августа Кекуле, физика Августа Кундта и минералога Пауля Грота. В значительной степени под влиянием Кекуле, уделявшего мало внимания лабораторным занятиям, интерес к химии у Ф. стал ослабевать, и он потянулся к физике. В 1872 г. по совету своего кузена, химика Отто Фишера, он перешел в Страсбургский университет, где под влиянием одного из профессоров, молодого химика органика Адольфа фон Байера, у Ф. вновь возник интерес к химии. Вскоре Ф. окунулся в химические исследования и был замечен после открытия фенилгидразина. После получения докторской степени в 1874 г. он занял должность преподавателя в Страсбургском университете. Когда в следующем году Байер получил пост в Мюнхенском университете, Ф. дал согласие стать его ассистентом. В 1878 г. Ф. стал приват-доцентом Мюнхенского университета, а в 1897 г. - адъюнкт-профессором аналитической химии. Спустя три года он оставил Мюнхен и стал профессором химии в Эрлангенском университете. Там он исследовал такие соединения, как кофеин, теобромин (алкалоид), мочевую кислоту и гуанин, который, как он обнаружил, получается из бесцветного кристаллического вещества, названного им пурином. Мочевая кислота была открыта значительно раньше (в 1776 г.) Карлом Вильгельмом Шееле, а в 1820 г. Фридлиб Фердинанд Рунге выделил кофеин. Однако Ф. доказал, что соединения эти имеют подобную структуру и могут быть синтезированы один из другого. Продолжая работать над этой темой вплоть до 1899 г., Ф. синтезировал большое число производных пуринового ряда, включая и сам пурин (1898 г.). Пурин - важное соединение в органическом синтезе, так как оно, как было открыто позднее, является необходимым компонентом клеточных ядер и нуклеиновых кислот. После занятия в 1885 г. поста профессора химии в Вюрцбургском университете Ф. продолжил свои исследования пуриновых производных. Он также интересовался проблемами стереохимии молекул сахаров. Применив принцип асимметрии атомов углерода (опубликованный в 1874 г. Якобом Вант-Гоффом), Ф. предсказал все возможные трансформации атомных структур для соединений класса сахаров; к 1890 г. он смог в лаборатории синтезировать маннозу, фруктозу и глюкозу. В 1892 г. Ф. стал директором Химического института Берлинского университета и занимал этот пост до самой смерти. Расширив область исследования от сахаров до ферментов, он открыл, что ферменты реагируют только с веществами, с которыми они имеют химическое родство. Проводя исследования с белками, он установил число аминокислот, из которых состоит большинство белков, а также взаимосвязь между различными аминокислотами. Со временем он синтезировал пептиды и классифицировал более сорока типов белков, основываясь на количестве и типах аминокислот, образовавшихся при гидролизе. Активный сторонник фундаментальных исследований, Ф. проводил кампанию в защиту таких междисциплинарных проектов, как экспедиция по наблюдению за солнечным затмением для проверки теории относительности. Ориентируясь на политику Рокфеллеровского фонда, которая позволила направить деятельность американских ученых исключительно на фундаментальные исследования, Ф. в 1911 г. получил денежные средства для создания Института физической химии и электрохимии кайзера Вильгельма в Берлине. В 1914 г. он получил оборудование для создания Института исследований угля кайзера Вильгельма в Мюльгейме.

В 1902 г. Ф. была присуждена Нобелевская премия по химии “в качестве признания его особых заслуг, связанных с экспериментами по синтезу веществ с сахаридными и пуриновыми группами”. Говоря об исследованиях сахаров, Ф. в Нобелевской лекции заявил, что “постепенно завеса, с помощью которой Природа скрывала свои секреты, была приоткрыта в вопросах, касающихся углеводов. Несмотря на это, химическая загадка Жизни не может быть решена до тех пор, пока органическая химия не изучит другой, более сложный предмет - белки”.

В 1888 г. Ф. женился на Агнессе Герлах, дочери профессора анатомии Эрлангенского университета, у них было трое сыновей. Его старший сын Герман стал профессором биохимии Калифорнийского университета в Беркли. Жена Ф. умерла через семь лет после замужества.

После длительных контактов в лаборатории с фенилгидразином у Ф. образовались хроническая экзема и желудочно-кишечные нарушения, что в 1919 г. привело его к смерти. Рихард Вильшеттер считал его “не имеющим равных классиком, мастером органической химии как в области анализа, так и в области синтеза, а в личностном отношении прекраснейшим человеком”. В его честь Германское химическое общество учредило медаль Эмиля Фишера. Среди его многочисленных премий и наград были медаль Дэви Лондонского королевского общества, прусский орден “За заслуги” и орден Максимилиана за заслуги в искусстве и науке. Он был почетным доктором университетов Осло, Манчестера, Брюсселя и Кембриджа. Являлся членом Прусской академии наук и президентом Германского химического общества. Ф. создал одну из самых обширных в истории науки научную школу, учениками которой были представители самых разных стран, в том числе и России. Среди его учеников - Отто Дильс, Адольф Виндаус, Фриц Прегль, Отто Варбург.

Источник информации:

Лауреаты Нобелевской премии: Энциклопедия: Пер. с англ.- М.:Прогресс, 1992.

К моменту начала работы над проблемой строения белка Фишер был уже всемирно признанным авторитетом. Он прославился своими фундаментальными исследованиями пуриновых соединений, а также расшифровкой строения сахаров. За последние работы он был награжден второй в истории химии Нобелевской премией. Первым среди химиков эту награду получил Я.Вант-Гофф в 1901 г.

В решении проблемы строения белка решающую роль сыграла высказанная Фишером гипотеза о том, что белки образованы аминокислотами, соединенными друг с другом амидной связью: -NH-CO-.

Такой тип связи Фишер назвал пептидной, а белок представил в виде состоящего из аминокислот цепочечного полимера.

Обосновывая пептидный тип соединения аминокислот в белковые молекулы, Фишер исходил из следующих экспериментальных фактов:

1. При гидролизе белков и их ферментативном расщеплении образуются различные аминокислоты.

2. В молекулах белков содержится небольшое количество свободных амино- и карбоксильных групп, т.е. соединение аминокислот в цепь происходит так, что эти группы маскируют друг друга.

При разработке стратегии доказательства строения белков Фишер сформулировал четыре основных направления исследований:

1. качественное и количественное определение продуктов полного гидролиза белков;

2. установление строения конечных продуктов гидролиза;

3. синтез полимеров из аминокислот, соединенных пептидными связями;

4. сравнение свойств полученных пептидов с природными белками

Успешная реализация намеченной программы привела Фишера к успеху. Работая над ней он параллельно уже в 1899-1900 гг. впервые доказал, что в состав белков входят только L-стереоизомеры аминокислот.

Сегодня уже хорошо известно, что функции белков в клетках очень сложны и многообразны. Есть белки переносчики веществ, белки-катализаторы реакций (ферменты), белки - регуляторы процессов в клетке, опорные и сократительные белки, белки защитники клетки от вирусов и чужеродных тел и т.д. Контакт клетки с окружением также выполняют разнообразные белки, способные “различать” формы молекул, температуру, фиксировать ничтожные количества примесей и т. п.

По своему брутто-составу белковые молекулы очень просты. В них входят в основном пять элементов: углерод, кислород, водород, азот и сера. При этом, белками контролируется масса разнообразнейших одновременно протекающих в клетке реакций. К примеру в простом одноклеточном образовании постоянно и одновременно осуществляются до 2-х тысяч реакций. Сама такая клетка, например E. Coli, состоит примерно из 5-ти тысяч различных молекул, не считая воду. Из этих 5-ти тысяч молекул на долю белков приходится более 3-х тысяч В организме человека насчитывается около 50000 разнообразных белков.

В настоящее время еще трудно оценить все многообразие белков в биосфере. Ориентировочно, количество встречающихся в природе различных по строению и функциям белков оценивается огромным числом: 10¹⁰ - 10¹², которые обеспечивают существование около 1,5∙10⁶ видов живых организмов различной сложности организации, начиная от вирусов и заканчивая человеком.

Итак, что же такое белок? Различия в аминокислотном составе, пространственном строении и функциях белков таковы, что пока трудно дать абсолютно точный и однозначный ответ на поставленный вопрос. Наиболее общее определение можно сформулировать примерно так. Белки (протеины) - это высокомолекулярные (полимерные) соединения, в которых аминокислоты (мономеры) последовательно соединены друг с другом в полимерную цепочку посредством пептидных (амидных) связей.

Все полимерные образования (независимо от того природного они происхождения или синтетического), мономерные звенья в которых представлены аминокислотами объединены общим названием - полипептиды или пептиды. Если пептид содержит в цепи более 50 мономерных звеньев его относят к белкам. Полипептиды с меньшим числом звеньев относят к пептидам. Эта граница выбрана условно и произвольно.

Белки отличаются друг от друга по структуре и функциям. Каждый из них обладает некоторыми, присущими только ему характерными особенностями. Вместе с тем белки имеют и ряд следующих присущих им общих признаков.

Элементный состав.

Характерной особенностью элементного состава белков является довольно постоянное содержание в них азота: 15-18% от сухой массы. Это позволяет оценивать содержание белков в анализируемых образцах, умножая количество найденного в них белкового азота на коэффициент 6.25. Значительные отклонения по содержанию азота (до 30%) наблюдаются для таких белков, как протамины. Содержание других элементов в белковых молекулах колеблется в следующих пределах:

> углерод 51 - 55%

> кислород 21 - 23%

> водород 6 - 7%

> сера 0.3 - 2.5%

Только по элементному составу, без учета других характеристических особенностей, белок нельзя отличить, однако, от других азотсодержащих соединений биологического происхождения.

2. Основными компонентами белков являются L-аминокислоты. D- аминокислоты в составе белков пока не обнаружены. Они встречаются в природных пептидах.

3. Аминокислоты соединены в белках посредством пептидной связи.

4. Белки от пептидов отличаются большей молекулярной массой (ММ), которая колеблется от нескольких тысяч до миллионов. Например:

> протамины  - 4000 - 8000

> инсулин   - 6300

> рибонуклеаза  - 13700

> гемоглобин человека - 68 000

> каталаза   - 240 000

> актомиозин  - 5 000 000

5. Большие значения молекулярных масс белков отличают их от природных пептидов, молекулярные массы которых не превышают, как правило, 1000. Есть исключения. Например, полипептид глюкагон, выделенный из поджелудочной железы, имеет ММ = 4000, а состоящие из D-глютаминовой кислоты гомополипептиды в клетках таких бактерий как картофельная и сенная палочка - до 50000. Следовательно, молекулярная масса, являясь важной и характерной особенностью белков, не есть все же достаточно строгим критерием для выделения белков из ряда природных и искусственных пептидов по этому признаку.

6. Одним из уникальных свойств белков является склонность их к денатурации - утрате ряда характерных физико-химических и биологических свойств под действием неблагоприятных внешних факторов. Процесс денатурации протекает без разрушения пептидных связей. Исключения встречаются, однако, и здесь. Известно немало белков, которые отличаются очень высокой устойчивостью к денатурации. Например, трипсин, химотрипсин и др. Кроме того, белки способны изменять свои физикохимические и биологические свойства и без денатурации. При этом они сохраняются в нативной (активной) форме и выполняют свои функции в живом организме.

7. Отличительной особенностью многих белков является их уникальная каталитическая активность (белки-ферменты). Эти белки контролируют практически все реакции в клетке.

8. Белки являются преобладающими компонентами клетки. В тканях человека, например, они составляют до 45% от их сухой массы. Наряду с этим, известны организмы и ткани, в которых содержание белка не превышает 1-4%.

9. Белки легко осаждаются из растворов 10-% трихлоруксусной кислотой. Это их свойство широко применяется в лабораторных исследованиях.

Способы разрушения тканей и клеток

Способы разрушения тканей и клеток условно можно разделить на 4-е группы:

1. механические

2. химические

3. ферментативные

4. смешанные

Механические способы

Для разрушения клеток чаще всего применяют механические приемы физического воздействия. Большинство животных клеток разрушаются при механических нагрузках сравнительно легко. Значительно труднее разрушаются растительные и бактериальные клетки из-за наличия у них прочных клеточных стенок.

Физические методы разрушения клеток подразделяются в зависимости от того, происходит ли оно под действием сил трения между клетками и твердыми веществами (растирание клеток с твердыми материалами) или гидродинамически (разрушение клеток в жидких средах).

Растирание клеток с твердыми материалами

Растирание клеток проводят с песком или другими абразивными порошками. Для разрушения животных клеток этот метод используется сейчас редко. Однако, его по прежнему применяют для разрушения растительных и бактериальных клеток. Недостаток метода - растирание может приводить к разрушению наиболее крупных клеточных органелл (хлоропластов, например).

Хорошие результаты получаются при продавливании смешанных с абразивными частицами клеток в различных прессах. Например, влажные клетки с абразивными частицами помещают в трубку, а затем однократным ударом по поршню создают скачок давления и продавливают клеточную массу через отверстие диаметром около 0.25 мм. Модификацией этого метода является продавливание клеток при отрицательных температурах. Роль абразивных частиц выполняют в этом случае кристаллы льда. Иногда клеточные оболочки разрушают путем многократного замораживания-размораживания ткани.

Разрушение клеток в жидких средах

Клетки, находящиеся в суспензии, разрушают в блендерах - аппаратах с быстро вращающимися или перемещающимися вдоль вертикальной оси лопастями. В некоторых блендерах вместо лопастей используется поршень или шары (гомогенизаторы). Лопасти блендеров вращаются с большими скоростями (от нескольких тысяч до десятков тысяч об/мин). Режущие лопасти блендеров заострены под прямым углом друг к другу. Стакан блендера охлаждают льдом. Блендеры широко применяются для фракционирования клеток.

Простые гомогенизаторы - это либо пестик, приводимый в движение вручную (гомогенизаторы Доунса и Тенбрека) либо механически (гомогенизатор Поттера-Эльвегейма) и стеклянный цилиндр. Необходимо, чтобы пестик и цилиндр были хорошо подогнаны друг к другу по диаметру, т.к. скорость растирания зависит не только от скорости вращения или перемещения пестика, но и от соотношения диаметров пестика и цилиндра.

Разрушение клеток высоким давлением

Этот метод применяется в основном для разрушения микробных клеток. Используют специальные прессы (френч-прессы), давление в которых до достигает 10⁸ Па. Конструкция этих прессов такова, что после достижения предельного давления проводят его резкий сброс через игольчатый клапан. В результате быстрого падения давления клетки

лопаются.

Разрушение клеток ультразвуком

При пропускании ультразвука через суспензию на клетки действует изменяющееся с высокой частотой давление, которое и разрушает их. Недостаток этого метода - выделение большого количествава тепла, что приводит к денатурации многих белков. Кроме того возможно и разрушение крупных, в том числе и белковых макромолекул.

Химические способы разрушения тканей и клеток

Ткани и клетки обрабатывают органическими растворителями и детергентами (поверхностно-активные вещества), облегчающими их разрушение. Для этих целей используют ацетон, этиловый спирт, глицерин, толуол, этилацетат и т. д.

Наряду с химическими агентами, для разрушения клеток используют и ферменты. Например, лизоцим “переваривает” клеточные стенки. Хорошо “работают” выделяемые из клеток препараты, содержащие целлюлазу, хитиназу, липазу и др.