Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022

Методы экспериментального исследования структуры белков
Методы очистки белков
Контроль чистоты выделяемого белка

Для контроля за чистотой белка используют методы количественного анализа белков. Наиболее ранний метод - определение количества белка по содержанию в нем азота. Разработаны два варианта: прямой и косвенный. В прямом методе белок осаждают из раствора трихлоруксусной кислотой. Осадок промывают и определяют содержание азота в белке. Косвенный - определяют общее содержание азота в растворе белка. Белок осаждают, отделяют и вновь определяют содержание азота в оставшемся маточном растворе. Разность полученных величин - есть количество белкового азота. Если содержание белка в растворе очень мало, а низкомолекулярные примеси богаты азотом, то измеренные количества азота (с белком и без белка) будут очень близки между собой. Косвенный метод в этом случае неприемлем из-за больших погрешностей.

Содержание азота определяют по методу Къельдаля, или в его микроварианте - методом Конвея. Суть метода. Белок кипятят с концентрированной серной кислотой и сульфатом калия. В качестве катализатора применяют чаще всего сернокислую медь. В продуктах реакции образуется сульфат аммония. В щелочной среде его переводят в аммиак. Последний оттитровывают соляной кислотой. Полученное количество азота умножают на коэффициент 6.25 (усредненное значение содержание азота в белках). Величина этого коэффициента весьма условна. Поэтому, всегда нужна определенная осторожность. В некоторых белках содержание азота может значительно отличаться от среднего (например, основные белки клеточного ядра). Расхождения могут быть двух и более кратными. Как правило, однако, в тривиальных случаях эти расхождения не превышают 5-10%.

Определение содержания белка по азоту - трудоемкая операция, требующая довольно больших количеств белка. Чаще, поэтому, прибегают к другим методам. В их числе.

> Биуретовая реакция. Биурет (NH₂CONHCONH₂) и другие соединения с пептидной связью дают сине-фиолетовое окрашивание при действии солей меди в щелочной среде. При обработке белковых растворов ионами меди появляется пурпурно-голубая окраска с λ_mах = 550 нм. Причина окрашивания - образование комплекса Cu²⁺ c пептидными связями. Интенсивность окрашивания в этой реакции пропорциональна числу пептидных связей и практически не зависит от других компонентов. Известны микроварианты этого метода, которые позволяют выполнять анализ белка в концентрации 0.15 мг/мл и менее.

> Метод Лоури. Получил наиболее широкое распространение. В методе сочетаются две реакции: на ароматические аминокислоты и биуретовая. Окрашивание проводят реагентом Фолина-Чикольте (Чокальтеу). В состав этого реагента входят ионы Cu²⁺, которые в присутствии сильных оснований и фосфомолибденвольфрамовой кислоты при взаимодействии с белком дают пурпурноголубое окрашивание. Окрашивание возникает в результате образования комплекса ионов меди с пептидными связями и реакции фофсфомолибденвольфрамовой кислоты с тирозином. Предполагают также некоторое участие в этой реакции остатков триптофана, гистидина, цистеина. Метод Лоури обладает более высокой чувствительностью, чем биуретовая реакция, и позволяет определять 0.01 - 0.05 мг/мл белка. Чувствительность в значительной степени зависит от содержания в белке ароматических аминокислот. По этой причине он практически неприменим для анализа коллагеновых белков, в которых очень низкое содержание ароматических аминокислот.

Основной недостаток метода - отсутствие линейной зависимости между оптической плотностью и концентрацией белка в более или менее широком диапазоне концентраций. Линейная зависимость наблюдается при содержании белка в растворе в пределах 15-40 мкг. По этой причине разработано несколько модификаций метода. Измерение оптической плотности чаще всего проводят при 500, 650, 750нм или других значениях длины волны, добиваясь получения линейной калибровочной прямой.

Второй недостаток метода - это его довольно высокая чувствительность ко многим примесям. В частности, к нуклеиновым кислотам.

> Метод Бредфорда. В основе предложенного Бредфордом метода лежит неспецифическое связывание красителей с белками, т.е. способность белков просто адсорбировать некоторые красители. Этот подход позволяет в ряде случаев получить воспроизводимые результаты при довольно высокой чувствительности. В общем же случае зависимость между степенью сорбции красителя и концентрацией белка, как правило, нелинейная. Для разных белков угол наклона калибровочной кривой сильно варьирует.

Наиболее распространенными красителями являются кумасси бриллиантовый голубой G-250 и кумасси R (фирмы Sigma) или BIO-RAD-реагент (производитель BIO-RAD Laboratories). Раствор белка после окрашивания красителями фотоколориметрируют при 595 нм (во всех модификациях метода Бредфорда).

Тщательные исследования метода Бредфорда показали, что линейная калибровочная прямая охватывает, в большинстве случаев, диапазон 0.5-50 мкг белка в пробе (0.5-10 мкг/мл). Описан микровариант метода Бредфорда.

> При наличии в лаборатории УФ-спектрофотометра для анализа белков можно воспользоваться таким их свойством, как поглощение света в УФ-области при длине волны λ_mах = 280 нм. На этой длине волны поглощают тирозин, триптофан и фенилаланин. Чувствительность метода довольно велика, около 0.2 мг/мл. Результаты значительно искажаются в присутствии нуклеиновых кислот, максимум поглощения для которых расположен в области 260 нм. Поэтому, оптическую плотность измеряют, как правило, при двух длинах волн: 260 и 280 нм. Это позволяет уменьшить неточности связанные с наличием в образце нуклеиновых кислот. Существуют специальные поправочные таблицы и формулы, позволяющие оценивать на основании спектроскопических данных соотношение белков и нуклеиновых кислот в образце.