Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022
Методы экспериментального исследования структуры белков
Методы определения молекулярной массы белков
Определение молекулярной массы методом седиментации - Определение молекулярной массы по скорости седиментации
Если приложенная к белковой молекуле центробежная сила много больше противодействующим ей силам диффузии, то молекула постепенно перемещается в направлении этой силы, т.е. осаждается в направлении от мениска к дну сосуда. Верху остается чистый растворитель, отделенный от раствора довольно отчетливой границей. За перемещением этой границы вдоль центрифужной кюветы можно наблюдать оптически, измеряя показатель преломления на разных расстояниях от мениска вдоль кюветы.
Рассмотрим в самых общих чертах этот метод. Во вращающейся в центрифуге кювете с раствором частица испытывает действие центробежной силы:
Fц/б = mω2r
где m - масса, ω - угловая скорость, r - расстояние до центра вращения.
Со стороны растворителя на частицу действует выталкивающая сила - Fвыт (или фактор плавучести), направленная против центробежной силы:
Fвыт = ω2rmvp
где V - парциальный удельный объем растворенных частиц. Его определяют как величину возрастания объема раствора (при большом избытке растворителя) после добавления к нему 1г сухого вещества (см /г). Для большинства белков v≅0.74 см3/г, р - плотность растворителя.
Кроме того, при движении растворенной частицы через растворитель возникает противодействующая этому движению сила трения:
Fтр = fV
где f - коэффициент трения, V - относительная скорость.
В стационарном гидродинамическом режиме растворенная частица движется с постоянной скоростью (без ускорения), поскольку все действующие на нее силы уравновешены (закон Ньютона):
Fц/б = Fвыт + Fтр
или:
mω2r - ω2rmvp - fV = 0
Откуда скорость равномерного оседания частицы равна:
Из последнего уравнения следует, что в гравитационном поле:
• скорость движения частицы пропорциональна ее массе;
• более плотные частицы с меньшим удельным объемом (v) будут двигаться быстрее менее плотных;
• с увеличением плотности раствора (р) скорость движения взвешенных в нем частиц уменьшается.
• скорость движения обратно пропорциональна величине коэффициента трения (f).
Перечисленные выше закономерности седиментации применимы ко всем частицам коллоидных растворов, независимо от их размеров.
В тех случаях, когда седиментационная граница белка перемещается с постоянной скоростью, т.е. при равенстве сил, скорость седиментации выражают через коэффициент седиментации - s:
s = V/ω2r
Коэффициенты седиментации для белков имеют величины 10-13 - 10-15 с. Обычно, s выражают в специальных единицах - Сведбергах (обозначают символом S); 1S = 10-13с. С возрастанием молекулярной массы белка коэффициент седиментации увеличивается. Простой пропорциональности здесь нет. Однако, зная величину s и располагая некоторыми дополнительными данными можно рассчитать молекулярную массу белка по уравнению Сведберга:
M = RTs/D(1-vp)
где D - коэффициент диффузии, R - универсальная газовая постоянная, T - абсолютная температура.
Для получения более надежных значений величины s и D измеряют в растворах с различной концентрацией белка и экстраполируют на бесконечное разбавление. Определенные так коэффициенты седиментации называются константами седиментации - s0.
Метод измерения скорости седиментации приводит к ошибочным результатам, если форма частиц сильно отклоняется от сферической. Особенно, если это длинные, тонкие, палочковидные молекулы. Кроме того, при вычислении молекулярной массы по уравнению Сведберга возникают довольно значительные погрешности из-за неточностей в определении величин V. Точное измерение v на небольших образцах белков почти невозможно.