Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022

Методы экспериментального исследования структуры белков
Методы определения молекулярной массы белков
Определение молекулярной массы методом седиментации - Метод приближения к седиментационному равновесию

Этот метод - есть компромисс между двумя вышерассмотренными методами. В нем нет присущей методу седиментационного равновесия точности, но достигнут существенный выигрыш во времени проведения измерений. В методе седиментационного равновесия требуются прецизионные измерение и поддержание скорости вращения ротора. В методе приближения к седиментационному равновесию скорость вращения ротора доводится до равновесной на протяжении 1 - 2 часов путем ряда последовательных подгонок (приближений). Каждый раз при этом измеряют концентрацию белка у дна кюветы. Из этих данных экстраполяцией определят ММ белка.

Метод центрифугирования в градиенте плотности. Этот метод получил широкое распространение не только для определения констант седиментации, но и для разделения смесей макромолекул, органелл и вирусов. Есть два варианта центрифугирования в градиенте плотности. В одном из них в центрифужной пробирке создается градиент плотности сахарозы. Достигают этого смешением автоматическими насосами концентрированного раствора сахарозы с водой в постепенно уменьшающихся соотношениях. Поверх раствора с градиентом наслаивают смесь макромолекул, растворенных в легком растворителе. При центрифугировании в качающемся горизонтальном роторе (“бакет-роторе”) макромолекулы каждого типа осаждаются вдоль градиента плотности с характерной для них скоростью. Она определяется в основном массой частиц. В результате осаждения образуются полосы или зоны. Хорошее разделение достигается быстро. Константу седиментации белка определяют исходя из положения его полосы в градиенте по отношению к положениям полос “белков-маркеров”, константы седиментации для которых известны.

Вторая модификация метода для определения молекулярной массы не применяется. Однако она весьма эффективна как способ разделения макромолекул с различными плотностями. В этом случае градиент концентрации заранее не создают. В качестве среды используют 6М раствор CsCl. Он обладает большой растворимостью, а его высококонцентрированные растворы малой вязкостью. В мощном гравитационном поле CsCl сам подвержен слабой седиментации, что и приводит к появлению градиента концентрации CsCl. Для установления этого градиента требуется обычно довольно продолжительное время: от нескольких часов до нескольких суток. Распределение плотности вдоль пробирки можно определить с высокой точностью. После центрифугирования со смесью белков они распределяются вдоль градиента плотности на полосы. При этом, каждая из полос оказывается в той части пробирки, в которой плотность раствора CsCl совпадает с плотностью белка. Такое центрифугирование обладает очень высокой разрешающей способностью и особенно успешно применяется при разделении смесей нуклеиновых кислот.