БИОХИМИЯ - Л. Страйер - 1984

ТОМ 3

ЧАСТЬ V. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЗИОЛОГИЯ

ГЛАВА 36. МЕМБРАННЫЙ ТРАНСПОРТ

36.2. Открытие системы активного транспорта ионов натрия и калия

Большинство животных клеток имеет высокую концентрацию К⁺ и низкую концентрацию Na+ по сравнению с окружающей клетку средой. Градиенты этих ионов создаются специфической транспортной системой, называемой (Na⁺ + К⁺)-насосом, поскольку движение этих ионов взаимосвязано. Активный транспорт Na⁺ и К⁺ имеет огромное физиологическое значение. В самом деле, в организме животного на этот процесс затрачивается более трети АТР, расходуемой в состоянии покоя. Градиенты концентрации Na+ и К+ регулируют объем клетки, обеспечивают электрическую возбудимость нервных и мышечных клеток и служат движущей силой для активного транспорта Сахаров и аминокислот (разд. 36.10).

В 1957 г. Йенс Скоу (Jens Skou) открыл фермент, гидролизующий АТР только при условии добавления Na⁺и К⁺ в содержащую Mg²⁺среду. Этот фермент был назван (Na⁺+ К⁺)-АТРазой:

Скоу предположил, что (Na⁺ + К⁺)-АТРаза является интегральной частью (Na+ + К+)-насоса и расщепление АТР обеспечивает энергией активный транспорт Na+ и К+. С тех пор был получен целый ряд доказательств того, что (Na⁺ + К⁺)-АТРаза - действительно составная часть (Na⁺ + К⁺)-насоса.

1. (Na⁺ + К⁺)-АТРаза обнаруживается во всех случаях, когда происходит активный транспорт Na⁺ и К⁺. Уровень ферментативной активности коррелирует с количеством транспортируемых ионов. Так, нервным клеткам свойственна высокая активность и (Na⁺ + К⁺)-АТРазы, и (Na⁺ + К⁺)-насоса, тогда как в эритроцитах оба этих показателя находятся на низком уровне.

2. И (Na⁺ + К⁺)-АТРаза, и насос прочно связаны с плазматической мембраной.

3. (Na⁺ + К⁺)-АТРаза и насос одинаково ориентированы в плазматической мембране.

4. Изменения концентраций Na⁺ и К⁺ оказывают одинаковое действие на АТРаз- ную активность и скорость транспорта этих ионов.

5. Кардиотонические стероиды являются специфическими ингибиторами и (Na⁺ + К⁺)-АТРазы, и (Na⁺ + К⁺)-насоса. Концентрация ингибитора, оказывающая полумаксимальный эффект, для обоих процессов одинакова.

Рис. 36.3. (Na⁺ + К⁺)-АТРаза [компонент Na⁺ + К⁺)-насоса] гидролизует АТР только в том случае, если в среде, содержащей Мg²⁺, одновременно присутствуют Na⁺ и К⁺

6. При обращении работы насоса в определенной ионной среде происходит синтез АТР из ADP и Рi.

36.3. И фермент, и насос ориентированы в мембране

Исследование (Na⁺ + К⁺)-насоса в тенях эритроцитов позволило установить, как ориентированы (Na⁺ + К⁺)-АТРаза и (Na⁺ + К⁺)-насос. В гипотонической солевой среде эритроцит набухает, и в его мембране появляются дырки. Из него выходит гемоглобин и остается светлая мембрана (тень). Содержимое набухшего эритроцита можно уравновесить с наружной средой. Если наружный раствор сделать изотоничным. то мембрана вновь становится барьером проницаемости. Следовательно, молекулярный и ионный состав среды внутри теней можно отрегулировать путем запечатывания их в соответствующей среде. Исследования процессов транспорта и ферментативной активности в тенях эритроцитов показало, что (Na+ + К+)-насос ориентирован следующим образом (рис. 36.4).

Рис. 36.4. (Na+ + К+)-насос строго ориентирован в плазматической мембране

1. Для активации АТРазы и переноса через мембрану ионы Na⁺ должны быть внутри, а ионы К⁺ - снаружи.

2. Только находящийся внутри клетки АТР служит эффективным субстратом АТРазы и используется для работы насоса.

3. Кардиотонические стероиды ингибируют насос и АТРазу только в том случае, если они находятся вне клетки (снаружи).

4. Ванадат-ионы ингибируют насос и АТРазу только при условии, что они находятся внутри клетки.

36.4. АТР транзиторно фосфорилирует натрий-калиевый насос

Каким образом АТР обеспечивает активный транспорт Na⁺ и К⁺? Ключом к решению этого вопроса оказалось наблюдение, что в присутствии Na⁺ и Mg²⁺ АТР фосфорилирует (Na⁺+ К⁺)-АТРазу. Участком фосфорилирования служит боковая цепь специфического остатка аспартата. Далее в присутствии К⁺ происходит гидролиз фосфорилированного промежуточного продукта (Е—Р). Для реакции фосфорили- рования не требуется К⁺, а для реакции дефосфорилирования не требуются ни Na⁺, ни Mg²⁺:

Nа⁺-зависимое фосфорилирование и К⁺- зависимое дефосфорилирование - не единственные реакции, имеющие критическое значение. В процессе функционирования насос принимает по крайней мере две разные конформации, обозначаемые как Е₁ и Е₂. Всего же в транспорте Nа⁺ и К⁺ и сопряженном с ним гидролизе АТР участвует не менее четырех конформационных форм фермента: Е₁, Е₁—Р, Е₂—Р и Е₂ (рис. 36.5). При гидролизе одной молекулы АТР происходит перенос трех ионов Nа+ и двух, ионов К⁺. Следовательно, работа насоса генерирует электрический ток через мембрану. Другими словами, (Na⁺ + К⁺)-АТРазный насос электрогенен. Максимальное число оборотов АТРазы составляет около 100 с^-1.

Рис. 36.5. Циклическое изменение конформации (Na+ + К+)-АТРазы в ходе катализа

Ионы ванадата (V⁵⁺) в наномолярных концентрациях ингибируют (Na⁺ + К⁺)- АТРазу. Этот пятивалентный ион фиксирует белок в форме Е₂. Ванадат является аналогом переходного состояния, образующегося при гидролитическом отщеплении фосфорильной группы, так как он способен принять бипирамидальную структуру, подобную той, какую дает фосфат (рис. 36.6).

Рис. 36.6. Строение ванадат-иона (V⁵+). Лиганды вокруг этого иона располагаются в виде двойной пирамиды, т.е. так же, как вокруг атома фосфора при гидролитическом отщеплении фосфорильной группы

36.5. Транспорт ионов и гидролиз АТР тесно сопряжены

Важная характеристика насоса состоит в том, что в отсутствие транспорта Na⁺ и К⁺ не происходит гидролиза АТР. Другими словами, система так сопряжена, что энергия АТР не растрачивается впустую. Прочное сопряжение - общая особенность биологических систем, опосредующих превращение энергии. Вспомним, что и в митохондриях условием нормального потока электронов в дыхательной цепи служит одновременное генерирование АТР (разд. 14.13). Другой пример сформулированного принципа - обязательное сопряжение гидролиза АТР и мышечного сокращения.

Действие (Na⁺ + К⁺)-насоса можно обратить так, чтобы он приводил к синтезу АТР. Суммарный синтез АТР из ADP и P_i происходит в условиях резко увеличенных ионных градиентов. Это достигается инкубацией эритроцитов в среде с очень высокой (по сравнению с нормой) концентрацией Na+ и очень низкой концентрацией К⁺.