БИОХИМИЯ - Л. Страйер - 1984

ТОМ 3

Часть IV ИНФОРМАЦИЯ

ГЛАВА 29. ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ ХРОМОСОМЫ И ВЫРАЖЕНИЕ ГЕНОВ У ЭУКАРИОТ

29.12. Гены, кодирующие рибосомные РНК, расположены один за другим тандемно и повторяются несколько сот раз

Гены, кодирующие молекулы рибосомных РНК, отличаются двумя особенностями. Во-первых, они повторяются тандемно один за другим. Почти у всех эукариот имеется более 100 копий этих генов. Во-вторых, большинство генов рРНК расположено в особых участках хромосом, ассоциированных с ядрышками. В клетках мутантов, лишенных ядрышек, синтезируется очень мало рРНК; поэтому они нежизнеспособны. Об этих генах многое известно, главным образом благодаря работам Мак-

са Бернстила, Доналда Брауна, Оскара Миллера (Max Bimstiel, Donald Brown, Oscar Miller) и их сотрудников. Гены, кодирующие четыре рибосомные PHK - 18S-, 5,8S-, 28S- и 5S-рРНК, были выделены в чистом виде из ДНК африканских шпорцевых лягушек Xenopus laevis и Xenopus mulleri. Выбор пал на шпорцевых лягушек по той причине, что их ооциты содержат особенно много этих генов.

Гены 18S-, 5,8S- и 28S-pPHK собраны вместе (образуют кластеры) и тандемно повторяются. Гибридизация in situ показала, что эти гены расположены в ядрышках. Повторяющаяся единица состоит из гена, кодирующего 40S-предшественник РНК и спейсер (рис. 29.21). 40S-предшественник (8kb) модифицируется и расщепляется, давая зрелые 18S-, 5,8S- и 28S-рРНК (разд. 29.21). Спейсер (нетранслируемый участок) не транскрибируется (рис. 29.22). Соматические клетки лягушек содержат примерно 500 копий этой повторяющейся единицы, и все они расположены друг за другом. В процессе оогенеза происходит удивительная избирательная амплификация (увеличение количества) этих генов. Они реплицируются несколько тысяч раз и дают примерно 2 • 10⁶ копий. Количество генов, кодирующих рРНК, достигает 75% всей ДНК ооцита. Амплифицированная ДНК представляет собой внехромосомные кольца, прикрепленные к множеству новых ядрышек. Такая избирательная амплификация гена позволяет ооцитам накопить 10¹² рибосом, необходимых для очень быстрого синтеза белка во время дробления. Если бы амплификации гена не было, образование 10¹² рибосом заняло бы несколько веков!

Рис. 29.21. Организация генов 408-предшественника 18S- 5,8S- и 28S-рРНК у ксенопуса. Тандемно повторяющиеся гены разделены нетранскрибируемыми участками (спейсерами). Длина повторяющегося элемента 13 кb

Рис. 29.22. На этой электронной микрофотографии ядрышковой ДНК ясно видна тандемная укладка генов 18S-, 5,8S- и 28S-pPHK. Толстая осевая нить - ДНК. Тонкие нити, отходящие в стороны, новообразованные молекулы РНК со связанными белками. Острый конец каждой «елочки», образованной синтезирующимися молекулами РНК, соответствует точке инициации транскрипции. Голые участки между острыми концами «елочек» - нетранскрибируемые спейсеры

Ген, кодирующий самую маленькую молекулу рибосом - 5S-pPHK, также тандемно повторяется. И соматические клетки, и ооциты содержат около 24000 копий этого гена, кодирующего молекулу РНК длиной 120 нуклеотидов. Эти гены собраны в группы (в кластеры) и располагаются на концах большинства хромосом лягушки. И в этом случае между генами данной рРНК имеется область нетранскрибируемого спейсера (рис. 29.23). На самом деле спейсер в несколько раз длиннее самого гена. Любопытно, что он содержит нетранскрибируемый псевдоген, последовательность оснований которого сходна с самим геном. Роль спейсера в этом и в других эукариотических генах остается загадкой.

29.13. Гены гистонов собраны вместе и повторяются тандемно много раз

Как организованы гены, кодирующие белки? Одними из первых были выделены и охарактеризованы гены гистонов благодаря изобилию гистоновой мРНК в быстро делящихся эмбрионах морского ежа. Эти морские беспозвоночные развиваются от стадии зиготы до стадии бластулы, содержащей 1000 клеток, за 10 ч. Поэтому для сборки нового хроматина необходимо синтезировать большое количество гистонов. Действительно, в период раннего эмбриогенеза гистоны составляют более четверти всего синтезированного белка. Гистоновая мРНК содержится в еще большем количестве - на ее долю приходится около 70% всех информационных РНК, синтезируемых на этой стадии, поэтому ее сравнительно легко выделить. После выделения гистоновой мРНК была исследована кинетика ее гибридизации с ДНК морского ежа для определения числа копий гистоновых генов. Скорость гибридизации была в несколько сот раз выше, чем она должна быть в случае уникальных последовательностей: это показывало, что для гистоновых генов характерна очень высокая повторяе- мостъ. Число копий гистоновых генов у различных видов морского ежа колеблется от 300 до 1000. У других организмов повторяемость ниже (табл. 29.4). Число копий гистоновых генов у того или иного организма, по-видимому, коррелирует с потребностью в быстром синтезе гистоновых мРНК.

Рис. 29.23. Организация генов 5S-pPHK Xenopus laevis. Эти тандемно повторяющиеся гены также разделены нетранскрибируемыми спейсерами. Повторяющийся элемент имеет длину примерно 750 пар оснований

Рис. 29.24. Световая микрофотография эмбриона морского ежа на стадии четырех клеток

Таблица 29.4. Повторяемость гистоновых генов¹

Как организованы в геноме многократно повторяющиеся гены гистонов? Для получения фракции ДНК, обогащенной генами гистонов, использовали тот факт, что эти гены содержат больше пар G—С (55%), чем большая часть ДНК морского ежа (42%), и, следовательно, имеют более высокую плавучую плотность. При расщепле-

нии такой обогащенной ДНК одной из рестриктирующих эндонуклеаз получались фрагменты длиной 7kb, которые гибридизовались с гистоновой мРНК. Затем эти фрагменты клонировали в клетках Е. coli и исследовали с помощью ферментов рестрикции и электронной микроскопии. Результаты исследований показали, что гены, кодирующие пять основных гистонов, сгруппированы вместе в составе основного повторяющегося элемента длиной 7 kb (рис. 29.25). В этом повторяющемся элементе пять кодирующих участков чередуются с пятью спейсерами. Кодирующие последовательности не прерываются вставочными последовательностями в отличие от других эукариотических генов, описанных выше (разд. 26.12). Группа из пяти гистоновых, генов повторяется тандемно много раз. Повторы очень сходны друг с другом, но не идентичны. Это согласуется с тем, что гистоны H1, H2A и Н2В представляют собой группы очень сходных белков, а не совершенно однородные полипептиды. В различных тканях и на разных стадиях развития экспрессируются различные гистоновые гены.

¹ Ген миозина содержит свыше 50 интронов! — Прим. перев.

Рис. 29.25. Карта сгруппированных в кластеры гистоновых генов морского ежа (Strongylocentrotus purpuratus) и плодовой мушки (Drosophila melanogaster). Кодирующие участки закрашены синим цветом, спейсеры (нетранскрибируемые участки) - желтым. Стрелки показывают направление транскрипции

Какова функциональная роль такой организации генов? Их повторяемость, несомненно, имеет важное значение для быстрого синтеза большого количества гистоновой мРНК. Но причина, по которой повторы собраны тандемно вместе, не очень ясна. Соседство генов, кодирующих пять гистонов, может быть, играет важную роль в координации их синтеза, чтобы гистоны Н2А, Н2В, Н3 и Н4 образовывались в эквимолярном количестве, а гистон H1 - в половинном.

29.14. Многие белки, синтезирующиеся в больших количествах, кодируются уникальными генами

Мы уже видели, что гены рибосомных РНК и гистонов повторяются много раз. Представлены ли гены, кодирующие большое количество продукта, большим числом копий? Для ответа на этот вопрос Доналд Браун (Donald Brown) выделил ген фиброина шелка шелковичного червя Bombyxmori. Выбор пал на эту систему потому, что мРНК, кодирующая фиброин шелка, имеет характерные структурные особенности. Она служит матрицей для повторяющихся последовательностей аминокислот, богатых глицином. Кроме того, гигантские клетки только одного типа синтезируют огромные количества фиброина шелка на определенной стадии развития. Для очистки РНК использовали ее большой размер (9,1 kb) и высокое содержание G по сравнению с рРНК и молекулами других РНК. Ген фиброина шелка также был частично очищен благодаря его необычно высокой плавучей плотности. Гибридизация очищенной фиброиновой мРНК с ДНК показала, что в гаплоидном геноме имеется только один ген фиброина шелка.

Рис. 29.26. Шелковичный червь

Этот результат имел чрезвычайно важное значение для изучения экспрессии генов и дифференцировки у эукариот. Он показал, что большие количества одного определенного белка могут быть синтезированы, даже если в геноме имеется только одна копия кодирующего его гена. Единственный ген фиброина шелка служит

матрицей для синтеза примерно 10 молекул мРНК, сохраняющихся в течение нескольких дней. Каждая молекула мРНК служит матрицей для синтеза порядка 10 молекул белка. Таким образом, одного гена хватает для синтеза порядка 10 молекул белка в течение четырех дней. Создается впечатление, что повторяющиеся гены рибосомных РНК и гистонов скорее представляют собой исключение, чем правило. Единственный ген фиброина шелка гораздо типичнее для генов, кодирующих белки, даже белки, синтезирующиеся в больших количествах. Например, ретикулоциты содержат одну или несколько копий генов, кодирующих субъединицы гемоглобина (разд. 29.26). Подобно этому, большие количества овальбумина - основного компонента яичного белка - синтезируются в яйцеводе пасущихся кур, клетки которого содержат только одну копию овальбуминового гена на гаплоидный геном. Однако не следует упускать из виду и возможность избирательной амплификации гена как способ увеличения синтеза того или иного белка в клетках определенного типа. Некоторые опухолевые клетки в культуре приобретают устойчивость к аналогам фолиевой кислоты путем синтеза 200-кратного количества дигидрофолят-редуктазы по сравнению с нормальными чувствительными клетками. Такое количество фермента возникает вследствие избирательной амплификации гена дигидрофолят-редуктазы. Очевидно, эукариотический геном представляет собой весьма динамичную систему.