Структурная биохимия - Учебное пособие - Е. А. Бессолицына 2015

Катализаторы — это вещества, ускоряющие химические реакции; в ходе реакции они претерпевают физические изменения, но по ее завершении возвращаются в исходное состояние. Ферменты — это биологические катализаторы. Большая часть ферментов является белками. Существуют рибозимы — ферменты, являющиеся молекулами РНК. К рибозимам относится РНК большой субъединицы рибосомы, осуществляющий биосинтез белка, РНКаза Р (англ.), осуществляющая разрезание предшественников тРНК, и интроны авотосплайсинга в митохондриях некоторых инфузорий.

В отличие от небелковых катализаторов (Н⁺, ОН^-, ионы металлов) каждый фермент способен катализировать лишь очень небольшое число реакций, часто только одну. Таким образом, ферменты представляют собой реакционно-специфические катализаторы. Практически все биохимические реакции катализируются ферментами.

Первоначально ферментам давали названия, образуемые путем добавления окончания -аза к названию субстрата, на который данный фермент действует. Так, ферменты, гидролизующие крахмал (амилон), были названы амилазами; ферменты, гидролизующие жиры (липос), — липазами; ферменты, гидролизуюшие белки (протеины), протеиназами. Позднее ферментам, катализирующим сходные по типу реакции, стали давать название, указывающее тип соответствующей реакции — дегидрогеназы, оксидазы, декарбоксилазы, ацилазы и т. д. Многие из этих названий используются и теперь. Номенклатура, введенная Международным биохимическим союзом (IUB), на первый взгляд кажется сложной и громоздкой, но зато она является однозначной. Главный ее принцип состоит в том, что ферменты называют и классифицируют в соответствии с типом катализируемой химической реакции и ее механизмом; это существенно облегчает систематизацию данных, относящихся к различным аспектам метаболизма. Основные черты системы, введенной IUB, состоят в следующем.

1. Реакции и ферменты, которые их катализируют, подразделяются на шесть классов, в каждом из которых имеется несколько подклассов (от четырех до 13).

2. Название фермента состоит из двух частей: первая часть — название субстрата (или субстратов); вторая указывает тип катализируемой реакции и оканчивается на -аза.

3. Дополнительная информация, если она необходима для уточнения, заключается в скобки. Например, фермент, катализирующий реакцию L-малат + NAD+ = Пируват + СО2 + NADH + Н +, имеет номер 1.1.1.37 и называется L-малат: NAD+ оксидоредуктаза (декарбоксилирующая).

4. Каждый фермент имеет кодовый номер по классификации ферментов (КФ): первая цифра характеризует класс реакции, вторая — подкласс и третья — подподкласс. Четвертая цифра указывает порядковый номер фермента в его подподклассе. Таким образом, КФ 2.7.1.1 означает, что фермент относится к классу 2 (трансфераза), подклассу 7 (перенос фосфата) и подподклассу 1 (акцептором фосфата является спирт). Последняя цифра обозначает фермент гексокиназу, или АТФ: D-гексозо-6-фосфотрансферазу т. е. фермент, катализирующий перенос фосфата с АТФ на гидроксильную группу атома углерода в шестом положении глюкозы. Ниже представлены все шесть классов ферментов и некоторые конкретные примеры. В скобках указано рекомендуемое название.

Ферменты делятся на шесть классов в соответствии с типом катализируемой реакции:

1. Оксидоредуктазы. Ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции с участием двух субстратов, S и Ś:

Sвосст + Śокисл =Sокисл+Śвосст

Катализируют реакции, в которых участвуют такие группы, как СН — ОН, СН — СН, С = О, СН — NH2 и — СН — NH — . Некоторые подклассы:

1.1. Ферменты, действующие на группу СН — ОН (донор электронов). Например:

1.1.1.1. Алкоголь: NAD+оксидоредуктаза [алкогольдегидрогеназа]

Спирт + NAD+ = Альдегид или кетон + NADH + Н+.

1.4. Ферменты, действующие на группу СН — NH2 (донор электронов). Например:

1.4.1.3. L-Глутамат: NAD (P) + оксидоредуктаза (дезаминирующая) [глутаматдегидрогеназа из печени животных]. Запись NAD (P) + означает, что акцептором электронов может служить либо NAD+, либо NADP+.

L-Глутамат + Н2О + NAD (P) + = = α-Кетоглутарат + NH+4 + NAD (P) H + Н+.

2. Трансферазы. Ферменты, катализирующие перенос группы G (отличной от атома водорода) с субстрата S на субстрат Ś:

S — G + Ś = Ś — G + S.

Катализируют перенос одноуглеродных групп, альдегидных или кетонных остатков, а также ацильных, алкильных, гликозильных групп и групп, содержащих фосфор и серу. Некоторые подклассы:

2.3. Ацилтрансферазы. Например:

2.3.1.6. Ацетил-СоА: холин О-ацетилтрансфераза [холин-ацетилтрансфераза]

Ацетил-СоА + Холин = СоА + О-Ацетилхолин.

2.7. Ферменты, катализирующие перенос группы, содержащей фосфор. Например:

2.7.1.1. АТР: D-гексоза 6-фосфотрансфераза [гексокиназа]

АТР + D-Гексоза = ADP + D-Гексозо-6-фосфат.

3. Гидролазы. Ферменты, катализирующие гидролиз эфирных, сложноэфирных, пептидных и гликозидных связей, кислотных ангидридов, связей С — С, С-галоида и Р — N.

S-Ś + H₂O = S + Ś

Например:

3.1. Ферменты, действующие на сложноэфирные связи. Например: 3.1.1.8. Ацилхолин — ацилгидролаза [псевдохолинэстераза]

Ацилхолин + Н₂О = Холин + Кислота.

3.2. Ферменты, действующие на гликозидные соединения. Например:

3.2.1.23. β-D-Галактозид — галактогидролаза [β-галактозидаза]

β-D-Галактозид + Н₂О = Спирт + D-Галактоза.

3.4. Ферменты, действующие на пептидные связи.

Классификация (с подразделением на 11 подклассов) учитывает различия между пептидазами и протеазами, выделяет ферменты, гидролизующие дипептиды или более крупные пептиды, отщепляющие одну или большее число аминокислот, атакующие связь на С- или N-конце. Протеиназы в соответствии с механизмом катализа подразделяются на сериновые, тиоловые и металлозависимые. Например:

3.4.21. Сериновые протеиназы. Например: Химотрипсин, трипсин, плазмин, факторы свертывания крови IХа и ХIа.

3.4.23. Карбоксильные (кислые) протеиназы. Например, пепсины А, В и С.

4. Лиазы. Ферменты, отщепляющие группы от субстратов по негидролитическому механизму, с образованием двойных связей.

Рисунок 79. Схема работы лиаз

Ферменты, действующие на связи С — С, С — О, С — N, С — S и С — галоид. Некоторые подгруппы:

4.1.2. Альдегид-лиазы. Например:

4.1.2.7. Кетозо-1 -фосфат-альдолаза [альдолаза]

Кетозо-1-фосфат = Дигидроксиацетонфосфат +Альдегид.

4.2. Углерод — кислород лиазы. Например:

4.2.1.2. L-малат — гидролиаза [фумараза]

L-малат = Фумарат + Н₂О.

5. Изомеразы. В этот класс включены все ферменты, катализирующие взаимопревращения оптических, геометрических и позиционных изомеров.

S _D↔ S _L

Некоторые подклассы:

5.2. Цистранс-изомеразы. Например:

5.2.1.3 11 -цис-транс-изомераза [ретинальизомераза]

5.3. Ферменты, катализирующие взаимопревращение альдоз и кетоз. Например:

5.3.1.1. D-Глицеральдегид-3-фосфаткетол-изомераза [триозофосфатизомераза]

D-Глицеральдегид-3-фосфат = Дигидроксиацетонфосфат.

6. Лигазы. (от лат. лигаре — связывать). Ферменты, катализирующие соединение двух молекул, сопряженное с разрывом пирофосфатной связи АТР или подобного соединения. В этот класс включены ферменты, катализирующие реакции, в ходе которых образуются связи С — О, С — S, С — N и С — С.

S + Ś = S-Ś

Некоторые подклассы:

6.3. Ферменты, катализирующие образование связей С — N. Например:

6.3.1.2. L-Глутамат: аммиак лигаза (ADP) [глутаминсинтетаза]

АТР + L-Глутамат + NH₄⁺ = ADP + Ортофосфат + L-Глутамин.

6.4. Ферменты, катализирующие образование связей С — С. Например:

6.4.1.2. Ацетил-СоА: СО₂ лигаза (ADP) [ацетил-Со А — карбоксилаза]

АТР + Ацетил-СоА + СО₂ = ADP + Р; + Малонил-СоА.

Холофермент — полностью функциональная молекула фермента

Апофермент — белковая часть фермента

Кофермент — специфическое термостабильное низкомолекулярное органическое соединение, которое участвует в ферментативной реакции в качестве дополнительного субстрата, принимающего на себя группировки в одного субстрата, и передавая их на другой. По сути являющееся постоянно связанным с каталитическим центром вторым субстратом.

Если фермент простой белок, то холофермент = апофермент.

Если фермент сложный белок, холофермент = апофермент + кофермент.

В ходе реакции кофермент претерпевает химические изменения, в точности противоположные изменениям, которые происходят в субстрате. Например, в окислительно-восстановительных дегидрогеназных реакциях молекула субстрата окисляется, а молекула кофермента восстанавливается. Подобным же образом в реакциях переаминирования пиридоксальфосфат выступает и как второй субстрат в двух связанных реакциях, и как переносчик аминогруппы между различными α-амино- и α-кетокислотами.

Вторая причина, по которой кофермент можно считать равноправным участником реакции, заключается в том, что именно его участие может иметь фундаментальное физиологическое значение. Например, работа мышцы в анаэробных условиях сопровождается превращением пирувата в лактат. Но в этом случае важны совсем не лактат и не пируват: предназначением реакции является превращение NADH в NAD+. В отсутствие NAD+ гликолиз продолжаться не может и анаэробный синтез АТР (а, следовательно, и работа мышцы) прекращается. Восстановление пирувата до лактата в анаэробных условиях обеспечивает окисление NADH в NAD+, необходимый для синтеза АТР. Функцию образования NAD+ могут выполнять и другие реакции.

Значение этого процесса становится очевидным, если перейти от животных к другим формам жизни. У бактерий и дрожжей, растущих в анаэробных условиях, вещества, образующиеся из пирувата, служат окислителями для NADH, при этом сами они восстанавливаются.

Кофермент может быть связан с апоферментом ковалентными или нековалентными связями. К числу реакций, требующих присутствия коферментов, относятся окислительно-восстановительные реакции, реакции переноса групп и изомеризации, а также реакции конденсации (по системе IUB это классы 1, 2, 5 и 6). Реакции расщепления, например гидролитические реакции, катализируемые пищеварительными ферментами, протекают в отсутствие кофермента.

Можно предложить следующую классификацию коферментов (Таблица 3):

Таблица 3. Классификация коферментов

Все химические реакции происходят в соответствии с теорией столкновений.

Кинетическая теория, или теория столкновений, основывается на двух ключевых положениях.

1. Чтобы столкновение было продуктивным (т. е. приводило к протеканию реакции), реагирующие молекулы должны обладать энергией, достаточной для преодоления энергетического барьера.

Отсюда следует, что при наличии у реагирующих молекул достаточной энергии все факторы, повышающие частоту их столкновений, будут повышать скорость реакции. И наоборот, факторы, понижающие частоту столкновений молекул или их кинетическую энергию, снижают скорость реакции.

Если не все молекулы в популяции обладают энергией, достаточной для осуществления реакции, то повышение температуры, сопровождающееся увеличением кинетической энергии молекул, приведет к повышению скорости реакции. В случае А ни одна из молекул, в случае Б — часть, а в случае В — все молекулы обладают кинетической энергией, достаточной для преодоления энергетического барьера.

Эта энергия столкновений получила название энергии перехода. То есть молекулы обладающие дополнительной энергией, сталкиваясь, вступают в реакцию.

Как и любой катализатор, ферменты понижают энергию перехода. В обоих случаях величина свободной энергии образования переходного состояния характеризует энергетический барьер полной реакции (Рисунок 80). Но энергетический барьер реакции, проходящей через переходное состояние [Y-R-•Х], ниже, чем энергетический барьер реакции, проходящей через переходное состояние [Y-R-X]. В приведенном выше примере [Y-R-X] представляет собой переходное состояние некатализируемой реакции, тогда как [Y-R-X] b — это переходное состояние катализируемой реакции. Все катализаторы, включая и ферменты, уменьшают свободную энергию образования переходного состояния ΔG₀. Заметим далее, что на величину ΔG₀ катализатор не влияет: изменение свободной энергии полной реакции не зависит от присутствия катализаторов. Константа равновесия химической реакции является функцией изменения стандартной свободной энергии этой реакции:

ΔG₀ = -RT ln Keq

Отсюда следует, что ферменты и другие катализаторы не влияют на константу равновесия реакции.

2. Для протекания реакции молекулы должны сталкиваться друг с другом, т. е. сближаться на расстояния, достаточные для образования связей. Для этого можно повысить концентрацию реагирующих веществ, а можно объединить их в одной точке пространства, увеличив концентрацию локально, что часто происходит в ходе функционирования катализаторов.

Такое ее представление подчеркивает три важных признака ферментативных реакций переноса групп.

1. Каждая полуреакция сопровождается и разрывом, и образованием ковалентной связи.

2. Фермент является равноправным реагентом, таким же, как D — G и А.

3. В то время как в полной реакции фермент выполняет функцию катализатора (т. е. он требуется лишь в следовых количествах и возвращается в исходное состояние по окончании реакции), в каждой из полуреакций фермент выступает как стехиометрический реагент (т. е. реагирует с другими реагентами в молярном отношении 1:1). Многие другие биохимические реакции можно рассматривать как частные случаи реакций переноса, в которых отсутствуют либо А, либо D, либо оба реагента. Так, реакцию изомеризации (например, взаимопревращение глюкозо-6-фосфата и глюкозо-1-фосфата) можно представить как реакцию переноса, в которой отсутствуют D и А.

Рисунок 80. Механизм действия ферментов. А — график изменения энергии в ходе химической реакции, Б — локальное изменение концентрации в ходе работы ферментов

Из всего сказанного выше ясно, что для протекания реакции необходимо, чтобы все участвующие в ней реактанты сближались на расстояния, достаточные для образования (или для разрыва) связей, т. е. сталкивались друг с другом. В химии гомогенных растворов концентрация реагирующих молекул в отсутствие катализаторов считается постоянной во всем растворе. Однако в присутствии катализатора это условие перестает соблюдаться. Для эффективной работы катализатор должен иметь на своей поверхности участки связывания реагирующих молекул. Такое связывание представляет собой обратимый процесс, однако равновесие сильно сдвинуто в сторону образования комплекса. Качественно это можно представить следующим образом:

Реактант + Катализатор = Комплекс реактанта с катализатором.

Прочность комплекса реактанта R и катализатора С можно охарактеризовать количественно с помощью константы диссоциации комплекса R — С (Кd) Отсюда можно получить одно важное следствие: связывание реактанта с катализатором приводит к заметному повышению локальной концентрации реагента по сравнению с его концентрацией во всем растворе.

Если катализатор биомолекулярной реакции (идущей с участием двух реактантов) связывает оба реактанта, то локальная концентрация каждого из них повышается, причем степень этого повышения зависит от сродства катализатора к данному реактанту (Kd). Одним из ключевых факторов, позволяющих ферменту служить катализатором, является его способность эффективно связывать один или (чаще) оба реактанта, участвующие в бимолекулярной реакции, что приводит к повышению локальной концентрации реактантов и, следовательно, к локальному повышению скорости реакции. То обстоятельство, что ферменты по сравнению с большинством небелковых катализаторов необычайно эффективны и высокоизбирательны, требует дальнейшего объяснения. Чтобы понять эти отличительные свойства ферментов, мы должны ввести понятие активного, или каталитического, центра.

Размеры белков намного превышают размеры низкомолекулярных субстратов, в связи с чем возникло представление о том, что в катализе участвует лишь ограниченная область молекулы фермента. Эту область мы и называем каталитическим центром. Каталитический центр — это несколько аминокислотных остатков, формирующих особую часть белка, в которой происходит ферментативная реакция. Вначале было непонятно, почему молекулы ферментов столь велики, если только часть их структуры участвует в связывании субстрата и непосредственно в катализе. Однако, как показал анализ трехмерной структуры ферментов, с субстратом взаимодействует намного большая часть белковой молекулы, чем предполагалось ранее. Если еще учесть включение в работу ферментов аллостерических центров такого же размера не приходится удивляться объемности ферментов.

Большинство субстратов образует, по меньшей мере, три связи с ферментом. Благодаря такой «трехточечной фиксации» симметричная молекула может проявлять асимметрию. Чтобы это пояснить, представим область фермента, связывающую субстрат, как участок плоской поверхности (хотя, как мы вскоре увидим, субстратсвязывающая «площадка» фермента редко бывает плоской, а возможно, и не бывает совсем). Если молекула субстрата может подойти к этому участку только с одной стороны, и взаимодействовать могут только комплементарные структуры субстрата и фермента (в реальных ферментах оба этих условия соблюдаются), то молекула субстрата может связываться с ферментом единственным способом, даже если группы 1 и 3 идентичны. Перебирая мысленно все возможные пространственные ориентации молекулы субстрата, можно убедиться, что с тремя точками плоской поверхности (с одной и той же стороны) молекула может связаться только в одной ориентации. Отсюда следует, что группы 1 и 3, хотя они и идентичны, при связывании с ферментом становятся неэквивалентными из-за различия в их окружении. Химические изменения будут происходить только с группой 1, но не с группой 3 (или наоборот). Обобщая эти рассуждения, можно объяснить теперь, почему ферментативное восстановление оптически неактивного пирувата приводит к образованию именно L-, а не D, L-лактата. Именно такой способ присоединения обеспечивает специфичность фермента.

Рисунок 81. Механизм связывания минимум в 3-х точках

Специфичность ферментов — это способность фермента катализировать одну и только одну специфическую реакцию является, пожалуй, наиболее важным его свойством. Благодаря этому скорости специфических метаболических процессов могут регулироваться путем изменения каталитической активности специфических ферментов. Правда, многие ферменты катализируют реакции одного типа (перенос фосфата, окислительно-восстановительные реакции и т. д.), субстратами при этом является небольшое число структурно сходных соединений. Реакции с альтернативными субстратами происходят в тех случаях, когда эти субстраты присутствуют в высоких концентрациях. Протекают ли в живых организмах все реакции, возможные при участии данного фермента, зависит от относительной концентрации альтернативных субстратов в клетке и относительного сродства фермента к этим субстратам.

За исключением эпимераз (рацемаз), которые катализируют взаимопревращение оптических изомеров, ферменты в общем случае проявляют абсолютную оптическую специфичность, по крайней мере, по отношению к одному из участков молекулы субстрата. Так, ферменты гликолитического и прямого окислительного пути катализируют превращения только D-, но не L-фосфосахаров. За единичными исключениями (например, почечная оксидаза D-аминокислот) большинство ферментов млекопитающих катализирует превращение только L-изомеров аминокислот.

Оптическая специфичность может относиться как к фрагменту молекулы, так и к молекуле в целом. Иллюстрацией служит специфичность гликозидаз. Эти ферменты катализируют гидролиз гликозидных связей между сахаром и спиртовой группой: они высоко-специфичны как к сахарному фрагменту, так и к характеру гликозидной связи (α или β), но относительно неспецифичны к спиртовому фрагменту молекулы.

Литические ферменты действуют на специфические химические группировки: гликозидазы — на гликозидные связи, пепсин и трипсин — на пептидные связи. Действие этих ферментов распространяется на большое число субстратов, что позволяет организму обойтись небольшим числом пищеварительных ферментов — иначе их потребовалось бы намного больше.

Отдельные литические ферменты отличаются более высокой группоспецифичностью. Так, химотрипсин гидролизует преимущественно пептидные связи, в которых карбоксильная группа принадлежит ароматическим аминокислотам — фенилаланину, тирозину или триптофану. Карбоксипептидазы и аминопептидазы отщепляют аминокислоты по одной с карбоксильного или с амино-конца соответственно.

Некоторые оксидоредуктазы способны использовать в качестве акцепторов электронов и NAD+, и NADPH, но большая их часть использует только один из них. Обобщая, можно сказать, что оксидоредуктазы млекопитающих, которые участвуют в биосинтетических процессах (например, в синтезе жирных кислот или стероидов), обычно используют в качестве восстановителя NADPH, тогда как в катаболизме участвуют оксидоредуктазы использующие NADH.

Первоначальная модель каталитического центра, предложенная Эмилем Фишером, трактовала взаимодействие субстрата и фермента по аналогии с системой «ключ — замок». Эта модель, которую иногда называют моделью «жесткой матрицы», не утратила своего значения для понимания некоторых свойств ферментов, например их способности к строго определенному связыванию двух или большего числа субстратов, или для объяснения кинетики насыщения субстратом (Рисунок 82 А).

Рисунок 82. Модели взаимодействия фермента и субстрата. А-модель «ключ-замок», Б-модель индуцированного соответствия

Недостатком модели Фишера является подразумеваемая в ней жесткость каталитического центра. Более общий характер имеет модель индуцированного соответствия (Рисунок 82 Б), предложенная Кошландом. Эта модель основывается на весьма убедительных экспериментальных данных. Ее существенной чертой является гибкость каталитического центра. В модели Фишера каталитический центр считается заранее подогнанным под форму молекулы субстрата. В модели же индуцированного соответствия субстрат индуцирует конформационные изменения фермента, и лишь в результате этих изменений аминокислотные остатки и другие группы фермента принимают пространственную ориентацию, необходимую для связывания субстрата и катализа. При этом другие аминокислотные остатки могут погрузиться в глубь молекулы фермента. Субстрат по мере сближения с ферментом индуцирует в последнем конформационные изменения, в результате которых соответствующие группы занимают положение, необходимое для связывания субстрата и для катализа. Одновременно меняется пространственное расположение других остатков — Lys и Met теперь оказываются сближенными. Аналоги субстрата тоже могут вызывать конформационные изменения, но не все из них являются «правильными». При связывании истинного субстрата (А) все группы занимают нужное положение. При связывании же аналога субстрата — более объемного или, наоборот, меньшего по размеру — индуцируется неправильное расположение этих групп.

В лабораторных условиях на скорость ферментативных реакций влияют следующие факторы:

концентрация фермента

концентрация субстрата,

температура,

рН,

присутствие ингибиторов.

В некотором ограниченном интервале температур скорость ферментативной реакции повышается с ростом температуры. Коэффициент, указывающий, во сколько раз повышается скорость реакции при повышении температуры на 10°, называется температурным коэффициентом и обозначается Q₁₀. Для многих биологических реакций при повышении температуры на 10° скорость удваивается (Q₁₀ = 2) и, аналогично, при понижении температуры на 100 уменьшается вдвое. Многие физиологические процессы (например, скорость сокращения изолированной сердечной мышцы) тоже характеризуются коэффициентом Q₁₀, близким к двум. Однако при некой оптимальной температуре скорость реакции максимальна. Повышение скорости реакции по мере приближения к оптимальной температуре объясняется увеличением кинетической энергии реагирующих молекул. При дальнейшем повышении температуры кинетическая энергия молекулы фермента становится достаточной для разрыва связей, поддерживающих вторичную структуру фермента в нативном, каталитически активном состоянии (происходит тепловая денатурация фермента). Вторичная и третичная структура фермента разрушается, что сопровождается потерей каталитической активности. Денатурация фермента приводит к уменьшению скорости реакции из-за уменьшения концентрации фермента (катализатора).

Для большинства ферментов оптимальная температура равна или выше той температуры, при которой в норме находятся клетки. Для ферментов микроорганизмов, адаптировавшихся к обитанию в природных горячих источниках, оптимальная температура может быть близка к точке кипения воды.

Умеренные изменения рН оказывают влияние на ионное состояние фермента, а зачастую и субстрата. Как показывают измерения ферментативной активности при различных рН, оптимум активности находится обычно между рН 5,0 и 9,0. Вместе с тем отдельные ферменты, например пепсин, активны при значениях рН, лежащих далеко за пределами этого интервала.

Зависимость активности от рН определяется следующими факторами.

1. Денатурацией фермента при очень высоких или очень низких рН. При изменении рН ферменты могут претерпевать конформационные изменения. Для поддержания активной третичной или четвертичной структуры может оказаться необходимым присутствие определенного заряда на группе, удаленной от области связывания субстрата; именно такая ситуация наблюдается в случае гемоглобина. Если заряд этой группы изменится, могут произойти частичное развертывание белковой цепи, или, наоборот, компактизация молекулы, или же ее диссоциация на протомеры — во всех случаях с потерей активности.

2. Изменением величины заряда молекул субстрата или фермента. Активность фермента может изменяться в результате изменений либо его структуры, либо заряда функциональных остатков, участвующих в катализе или связывании субстрата. Рассмотрим для примера взаимодействие отрицательно заряженного фермента (Enz^-) с положительно заряженным субстратом (SH⁺). При низких рН происходит протонирование Enz^-, при высоких рН — депротонирование субстрата. Поскольку, взаимодействовать друг с другом могут только SH⁺ и Enz^-, при крайних значениях рН эффективная концентрация Enz^- или SH⁺ будет низкой, что приведет к снижению скорости реакции.

Во многих случаях бывает недостаточно знать, что данный фермент присутствует в системе, нужна еще информация о его количестве. При определенных условиях скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна количеству фермента. Это бывает не всегда, что можно проиллюстрировать на примере прямой реакции, идущей в равновесных условиях. Даже если мы знаем, что прямая реакция действительно идет, нам будет казаться, что скорость ее равна нулю, поскольку с такой же скоростью идет и обратная реакция. Когда же ферментативная реакция только начинается, продукт еще практически отсутствует и обратная реакция не идет. Кроме того, на начальной стадии реакции концентрация субстрата соответствует его исходному количеству. Поэтому скорость в начале реакции, т. е. ее начальная скорость (г), будет прямо пропорциональна концентрации фермента [Enz].

Фермент является реактантом, который соединяется с субстратом, образуя фермент-субстратный комплекс Enz — S, распадающийся на свободный фермент и продукт Р. В простейшей форме можно записать

Таким образом, концентрация фермента не оказывает влияния на константу равновесия. Кeq не зависит от того, каким образом достигается равновесие — с участием фермента или без него (вспомним о величине ΔG°). Фермент меняет путь, по которому идет реакция, но не конечные (равновесные) концентрации реагентов и продуктов, от которых зависят Кeq и ΔG°.

Таким образом концентрация фермента оказывает влияние на скорость ферментативной реакции только на начальных этапах ферментативной реакции, следовательно данный механизм воздействия на скорость ферментативной реакции не эффективен, поэтому не используется. С другой стороны можно использовать малые количества ферментов для полного прохождения реакции.

При изучении зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата были рассмотрены ферментативные реакции, в которых имеется единственный субстрат и единственный продукт. Такая ситуация действительно наблюдается для некоторых ферментативных реакций, однако большинство из них протекает с участием двух и более субстратов и продуктов. Это, однако, нисколько не снижает ценности дальнейших рассуждений. То, что справедливо для одного субстрата, остается верным и для двух.

При увеличении концентрации субстрата [S] и сохранении всех остальных условий начальная скорость v (скорость, измеряемая в период, когда израсходована очень малая доля субстрата) будет повышаться до максимальной величины Кmах, после чего останется постоянной.

По мере повышения концентрации субстрата скорость будет расти до тех пор, пока не произойдет насыщения фермента субстратом. Измеренная в таких условиях начальная скорость уже не будет возрастать при дальнейшем повышении концентрации субстрата. Отметим, что субстрат обычно берут в значительном молярном избытке по отношению к ферменту. Например, если фермент с мол. массой 100000 взаимодействует с субстратом с мол. массой 100 и оба присутствуют в концентрации 1 мг/мл, то на каждый моль фермента будет приходиться 1000 молей субстрата. Более реальными являются следующие величины:

[Enz] = 0,1 мкг/мл = 10^—9 М, [S] = 0,1 мг/мл = 10^—3 М,

т. е. молярный избыток субстрата по отношению к ферменту составляет 10⁶.

Даже если [S] уменьшить в 100 раз, его концентрация все еще в 10000 раз будет превышать концентрацию фермента. В точках А и В в комплексе с субстратом находится лишь часть молекул фермента, хотя молекул субстрата намного больше, чем молекул фермента. Это происходит потому, что константа равновесия реакции Enz + S +± Enz — S (образование комплекса Enz — S) хотя и велика, но конечна. Таким образом, в точках А и В повышение или понижение [S] будет приводить к увеличению или уменьшению доли молекул Enz, связанных с S (т. е. доли молекул Enz — S), и v будет зависеть от [S]. В точке С практически все молекулы фермента связаны с субстратом, и дальнейшее повышение [S], хотя и повысит частоту столкновений Enz с S, не сможет привести к повышению скорости реакции — среди молекул фермента уже не будет таких, которые были бы свободны для реакции с субстратом.

Случай В представляет особый теоретический интерес, поскольку при этом ровно половина молекул фермента насыщена субстратом. Соответственно скорость равна половине максимальной скорости (V_mdJ2), достижимой при данной концентрации фермента.

Уравнение Михаэлиса — Ментен описывает зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата. Фермент Е соединяется с субстратом S, образуя ES-комплекс; константа скорости этого процесса — k₁. Судьба ES-комплекса складывается двояко: он может либо диссоциировать на Е и S с константой скорости k₂, либо подвергаться дальнейшему превращению, образуя продукт Р, с константой скорости k₃(Рисунок 83—1). Постулируется, что продукт реакции Р не превращается в исходный субстрат S; это условие соблюдается на начальной стадии реакции, пока концентрация продукта не достигает ощутимого количества.

Как связана скорость катализа с концентрацией субстрата и фермента и скоростями отдельных этапов реакции? Начнем с того, что скорость ферментативной реакции равна произведению концентрации комплекса ES на константу k₃ (Рисунок 83—2).

Выразим [ES] через известные величины. Скорости образования и распада ES (Рисунок 83—3,4).

Определим скорость катализа в стационарных условиях. Стационарные условия характеризуются тем, что концентрация промежуточных продуктов остается постоянной, тогда как концентрации исходных и конечных продуктов меняются. Это имеет место в том случае, когда скорость синтеза ES-комплекса оказывается равной скорости его распада. Если левые части равенств равны между собой, то равны и правые (Рисунок 83—5).

Преобразуем это уравнение (Рисунок 83—6).

Уравнение можно упростить, если ввести новую константу Км, называемую константой Михаэлиса (Рисунок 83—7).

Введем Км в уравнение (Рисунок 83—8).

Рассмотрим числитель в последнем выражении. Концентрация несвязанного субстрата [S] практически равна общей концентрации субстрата при условии, что концентрация фермента значительно ниже концентрации субстрата. Концентрация несвязанного фермента (Е) равна общей концентрации фермента Ет минус концентрация комплекса ES (Рисунок 83—9).

Подставим это выражение в уравнение (Рисунок 83—10).

Решение уравнения относительно [ES] дает (Рисунок 83—11) или (Рисунок 83—12).

Подставим это выражение в уравнение скорости реакции (Рисунок 83—13).

После преобразования получаем окончательный вариант уравнения Михаэлиса — Ментен (Рисунок 83—15).

Рисунок 83. Вывод уравнения Михаэлиса-Ментен

Графическое определение константы Михаэлиса Км

Концентрация субстрата, при которой скорость составляет половину максимальной, обозначается через Км и называется константой Михаэлиса. Ее можно определить из графика зависимости v от [S]. Обратите внимание, что Км имеет размерность молярной концентрации.

Рисунок 84. График зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата (описывается уравнением Михаэлиса-Ментен)

Когда [S] приближается к Км, v становится весьма чувствительной к изменению [S]; в этой области фермент работает со скоростью, равной половине максимальной. Многие ферменты характеризуются такими значениями Км, которые примерно соответствуют физиологическим концентрациям их субстратов.

Уравнение Михаэлиса — Ментен описывает поведение многих ферментов при изменении концентрации субстратов (Рисунок 84). Используя это уравнение, зависимость начальной скорости ферментативной реакции от [S] и Км можно проиллюстрировать на следующих конкретных примерах.

1. [S] много меньше Км (точка А).

В этом случае величину [S] в знаменателе можно опустить, и он будет практически равен Км. Отношение двух констант, Vmax и Км, можно заменить новой константой К. Таким образом, имеем:

Другими словами, когда концентрация субстрата значительно ниже той, при которой скорость реакции составляет половину максимальной (т. е. значительно меньше Км), начальная скорость v пропорциональна концентрации субстрата [S].

2. [S] много больше Км (точка С). В этом случае член Км в знаменателе можно опустить, т. е. Это означает, что при концентрации субстрата [S], намного превышающей Kм начальная скорость v равна максимальной Vmax

3. [S] = Км (точка В). Это означает, что при концентрации субстрата, равной Км, начальная скорость реакции v составляет половину максимальной. Отсюда же следует способ оценки Км: надо экспериментально определить концентрацию субстрата, при которой начальная скорость равна половине максимальной.

Как видно из рисунка график, описываемый уравнением Михаэлиса-Ментен, является кривой, чтобы кривая была точной необходимо максимальное количество точек для ее построения, следовательно, необходимо множество замеров скорости реакции с разными концентрациями субстрата. Тогда как для построения прямой требуется всего 3—5 точек, следовательно 3—5 замеров, именно поэтому было проведено преобразование уравнения Михаэлиса-Ментен (Рисунок 85, 86). График делается в обратных координатах 1/V и 1/ [S]. Для преобразования необходимо 1 разделить на уравнение:

Рисунок 85. Преобразование Лайнуивера-Бэрка

Как видно из преобразования, данное уравнение можно свести к уравнению прямой у = ах + b, где y = l/V; x = 1/ [S]. Данное преобразование по фамилиям авторов получило название — преобразование Лайнуивера-Бэрка.

Используя график Лайнуивера-Бэрка на практике для оценки Км, иногда сталкиваются с тем, что почти все точки оказываются в области низких концентраций субстрата. Это происходит в том случае, когда измерения проводят через равные интервалы [S]. Чтобы этого избежать, измерения следует проводить при таких значениях [S], которые соответствуют равным интервалам по шкале обратных величин.

Рисунок 86. График преобразования Лайнуивера-Бэрка

Оценки Км имеют практическую ценность. При концентрациях субстрата, в 100 раз превышающих Км, фермент будет работать практически с максимальной скоростью, поэтому максимальная скорость (Vmах) будет отражать количество присутствующего активного фермента. Это немаловажное обстоятельство используют для оценки содержания фермента в препарате. Значение Км позволяет ориентироваться, какое количество субстрата следует добавить для определения Vmax. Графики, построенные в обратных координатах, находят широкое применение при оценке действия ингибиторов.

С другой стороны Км связана с константой диссоциации фермент-субстратного комплекса то есть со сродством фермента к субстрату (Рисунок 87).

Рисунок 87. Соотношение между Км и Кd

Сродство фермента к субстрату равно величине, обратной константе диссоциации К комплекса Enz — S:

Иными словами, чем слабее выражена тенденция фермент-субстратного комплекса к диссоциации, тем выше сродство фермента к субстрату. Мерой Kd может ориентировочно служить значение Км для данного фермента по отношению к его субстрату. Однако это возможно только в том случае, если справедливо допущение, использовавшееся при выводе уравнения Михаэлиса — Ментен. Оно состояло в том, что первая стадия ферментативной реакции идет быстро и при этом всегда на этой стадии поддерживается равновесие. Другими словами, скорость диссоциации Enz — S на Enz + S намного выше, чем скорость диссоциации на фермент — продукт: Из уравнения Михаэлиса — Ментен следует, что величина [S], при которой v = 1/2Vmax, равна

При этих условиях 1/KM =1/Кd и равно сродству фермента к субстрату. Если k2 + k-1 не равно k-1, то 1/Км даст заниженную оценку сродства.

Некоторые ферменты и другие лигандсвязывающие белки, например гемоглобин, не подчиняются классической кинетике насыщения Михаэлиса — Ментен. График зависимости v от [S] носит в этом случае сигмоидный характер. Это обычно указывает на кооперативное связывание субстрата многими центрами — связывание с одним центром влияет на связывание с другим, как это происходит с гемоглобином. В таком случае описанный выше метод графической оценки концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимальной, оказывается непригодным (прямой в соответствующих координатах уже не получается). Здесь следует обратиться к графическому представлению уравнения Хилла, первоначально предложенного для описания кооперативного связывания О₂ с гемоглобином.

Рисунок 88. Уравнение Хилла и график, им описываемый

Уравнение Хилла, преобразованное так, чтобы график в соответствующих координатах представлял собой прямую, имеет вид, где ќ — константа. Из уравнения следует, что в условиях, когда [S] мало по сравнению с ќ, скорость реакции возрастает как n-я степень [S]. Приведен график Хилла, построенный по кинетическим данным для фермента, характеризующегося кооперативным связыванием субстрата (Рисунок 88). График зависимости log (V/Vmax — V) от log [S] представляет собой прямую с тангенсом угла наклона, равным n, где п — эмпирический параметр, зависящий от числа субстрат связывающих центров и характера взаимодействия между ними. При п = 1 связывающие центры не зависят друг от друга. При п> 1 между центрами имеется кооперативное взаимодействие; чем больше п, тем выше степень кооперативности и тем более выражена сигмоидность кривых насыщения. При п <1 говорят об отрицательной кооперативности. Когда скорость реакции равна половине максимальной (V = Vmax/2, V/ (Vmax -V) = 1 и log [V/ (Vmax —V)] = 0. Таким образом, чтобы определить величину S50 (концентрацию субстрата, при которой скорость вдвое меньше максимальной), нужно из точки на прямой, для которой log [V/ (Vmax — V)] = 0, опустить перпендикуляр на ось х.

Ингибиторы — это химические вещества, которые уменьшают скорость ферментативной реакции.

Различают два больших класса ингибиторов ферментативной активности — конкурентные и неконкурентные — на основании того, ослабляется (конкурентное ингибирование) или не ослабляется (неконкурентное ингибирование) их ингибирующее действие при повышении концентрации субстрата. На практике многие ингибиторы не проявляют тех свойств, которые характерны для чисто конкурентного или чисто неконкурентного ингибирования. Другой способ классификации ингибиторов основывается на характере места их связывания. Одни из них связываются с ферментом в том же месте, что и субстрат (в каталитическом центре), а другие — на значительном расстоянии от активного центра (в аллостерическом центре). Так же ингибирование подразделятся

Конкурентное ингибирование аналогами субстрата

Классическое конкурентное ингибирование основано на связывании ингибитора с субстрат-связывающим (каталитическим) центром. Химическая структура аналога субстрата, действующего как ингибитор (I), обычно сходна со структурой субстрата (S). Поэтому ингибитор может обратимо связываться с ферментом, образуя вместо Enz — S комплекс Enz — I, т. е. фермент-ингибиторный комплекс. Когда в реакционной смеси одновременно присутствуют и субстрат, и. ингибитор указанного типа, они конкурируют за один и тот же связывающий центр на поверхности фермента. Один из наиболее подробно изученных примеров конкурентного ингибирования — это ингибирование сукцинатдегидрогеназы малонатом (I), конкурирующим за один и тот же центр с субстратом сукцинатом (S). В случае конкурентного ингибирования идет воздействие на Км, при повышении концентрации субстрата, вероятность связывания с ингибитором уменьшается и скорость реакции увеличивается, таким образом при конкурентном ингибировании скорость реакции может быть близкой к максимальной в норме, но при больших концентрациях субстрата.

Обратимое неконкурентное ингибирование

Как следует уже из самого названия, в этом случае конкуренция между субстратом (S) и ингибитором (I) отсутствует. При этом ингибитор обычно ничем не напоминает S и, как можно предположить, связывается с другим участком фермента. Обратимые неконкурентные ингибиторы понижают максимальную скорость, достижимую при данном количестве фермента (понижают Vmax),но, как правило, не влияют на Км. Поскольку I и S связываются с разными центрами, возможно образование как комплекса Enz — I, так и комплекса Enz — IS. Комплекс Enz — IS тоже распадается с образованием продукта, однако с меньшей скоростью, чем Enz — S; поэтому реакция будет замедляться, но не остановится. Таким образом, могут протекать следующие конкурентные реакции:

Необратимое неконкурентное ингибирование

Ферментативная активность может уменьшаться в присутствии многих «ядов», таких, как иодацетамид, ионы тяжелых металлов (Ag⁺, Hg²⁺) окисляющие агенты и т. д. В присутствии одного или нескольких субстратов или продуктов скорость инактивации фермента может снижаться. В данном случае ингибирование происходит за счет частичной денатурации фермента.

Клетка также регулирует скорость ферментативных реакций, для контроля своего метаболизма. Но клетка не может изменять температуру и рН своей среды, а изменение концентрации субстратов является сигналом для изменения скорости реакций. Такая ситуация связна с понятием гомеостаза. Гомеостаз — это состояние постоянных состава внутренней среды клетки и организма и их физиологических функций (температура и рН).

Поэтому в живой клетке скорость ферментативных реакций можно регулировать, изменяя следующие параметры:

1) абсолютное количество присутствующего фермента;

2) пул реагентов (помимо фермента);

3) каталитическую эффективность фермента.

Большинство форм жизни использует все три типа регуляции.

Регуляция количества фермента путем регуляции скорости его синтеза и распада

Абсолютное количество фермента в клетке определяется скоростями его синтеза (K_синт) и распада (K_расп). Соответственно количество фермента увеличивается либо в результате повышения скорости его синтеза (увеличением K_синт), либо снижения скорости распада (уменьшением K_расп), либо обоими способами сразу. Регуляция осуществляется на уровне экспрессии генов. Увеличивая скорость экспрессии генов прежде всего транскрипции и в меньшей степени трансляции можно увеличивать количество белка. Блокируя транскрипцию генов можно уменьшать до полного исчезновения количество закодированного в гене белка.

Превращение проферментов в активные ферменты

Ферментативная активность может регулироваться путем превращения неактивного профермента в каталитически активную форму. Чтобы перейти в такую форму, профермент должен подвергнуться ограниченному протеолизу, сопровождающемуся конформационными изменениями; при этом происходит либо демаскирование каталитического центра, либо его формирование. Синтез в форме каталитически неактивных проферментов является характерным свойством пищеварительных ферментов, а также ферментов системы свертывания крови и системы фибринолиза.

Компартментация ферментов

Роль компартментации (пространственного разделения) метаболических процессов в клетках эукариот, в том числе в клетках млекопитающих, трудно переоценить. Локализация специфических метаболических процессов в цитозоле или в клеточных органеллах облегчает независимую регуляцию этих процессов. Развитая компартментация метаболических процессов особенно характерна для высших форм живых организмов — она позволяет осуществлять наиболее тонкую регуляцию метаболизма. Одновременно при этом возникает новая проблема — прохождение метаболитов через разделяющие барьеры. Эта проблема решается с помощью «челночных механизмов», переводящих метаболит в форму, которая способна проходить через барьер. Затем по другую сторону барьера происходит обратное превращение метаболита в первоначальную форму. В связи с наличием барьеров возникает потребность в функционировании, например, цитозольной и митохондриальной форм некоторых ферментов. Поскольку эти формы фермента физически разделены, их независимая регуляция облегчается.

Аллостерическая регуляция

В случае аллостерической регуляции низко-молекулярные соединения или аллостерические регуляторы связываются с ферментом в результате происходит изменение конформации белка. Необходимо вспомнить что при при встраивании этой молекулы изменяются связи в составе белка, что характерно для связывания белка с любой молекулой в результате происходит перераспределение связей и как результат изменение конформации белка, эти молекулы могут привести к двум противоположным результатам. В зависимости от молекулы связи могут различаться, а, следовательно, и перестройки в молекуле белка, поэтому аллостеричекие модуляторы могут изменять конформацию белка либо в направлении увеличения сродства к субстрату, следовательно, увеличению активности белка, тогда молекула является положительным модулятором. И наоборот молекула, встраиваясь, изменяет конформацию белка, и в результате конформация белка становится менее активной, то есть происходит неконкурентное обратимое ингибирование.

Примерно в 1963 г. Моно обратил внимание на отсутствие структурного сходства между ингибитором, действующим на фермент по принципу обратной связи, и субстратом этого фермента. Отсутствие изостеричности с субстратом позволяет говорить об аллостеричности соответствующих эффекторов. Исходя из этого, Моно предположил, что ферменты, регулируемые такими аллостерическими эффекторами (в частности, ингибиторами по принципу обратной связи), связывают эффектор в аллостерическом центре, физически не совпадающем с каталитическим центром. Таким образом, аллостерические ферменты — это ферменты, активность каталитического центра которых изменяется под действием аллостерических эффекторов, связывающихся в аллостерическом центре. Данные о наличии у регуляторных ферментов физически обособленных аллостерических центров сводятся к следующему.

1.Регуляторные ферменты после модификации химическими или физическими методами часто становятся нечувствительны к аллостерическим эффекторам, сохраняя каталитическую активность.

2.Аллостерические эффекторы часто защищают каталитический центр от денатурации в условиях, когда субстрат такого защитного действия не оказывает.

3.Обнаружены мутантные клетки бактерий и млекопитающих, в которых регуляторные ферменты имели существенно иные регуляторные свойства, чем ферменты из клеток дикого типа, но обладали в точности такими же каталитическими свойствами.

4.Показано, что связывание субстратов и аллстерических эффекторов с регуляторным ферментом происходит независимо.

5.В некоторых ферментах (например, в АТКазе) аллостерический и каталитический центры локализованы в разных протеомерах.

Ковалентная модификация ферментов

Обратимое изменение каталитической активности ферментов может осуществляться путем ковалентного присоединения фосфатной группы (преобладает у млекопитающих) или нуклеотида (преобладает у бактерий). Ферменты, подверженные ковалентной модификации, которая сопровождается изменением их активности, называют обратимо модифицируемыми ферментами.

Обратимо модифицируемые ферменты могут находиться в двух состояниях, одно из которых характеризуется высокой, а другое — низкой каталитической эффективностью. В зависимости от конкретного случая более активным катализатором может быть либо фосфо-, либо дефосфофермент.

Обычно фосфорилируется специфический остаток серина и образуется остаток О-фосфосерина; реже фосфорилируется остаток тирозина с образованием остатка О-фосфотирозина. Хотя обратимо модифицируемый фермент может содержать много остатков серина или тирозина, фосфорилирование происходит в высшей степени избирательно и затрагивает лишь небольшое число (1—3) остатков. Эти участки, по всей вероятности, не являются частью каталитического центра; мы, таким образом, имеем еще один пример аллостерических эффектов.

Для модификации необходимы молекула — донор модифицирующей группировки и фермент, осуществляющий модификацию. У эукариот донором фосфатной группы для модификации является АТФ, модификацию осуществляют ферменты протеин киназы. Протеинкиназы — это очень большой класс белков, специфично фосфорилирующих различные ферменты. У прокариот донором АДФ-рибозы является NAD. Различие модифицирующих групп повлекло за собой расхождение модифицирующих и демодифицирующих ферментов. По этому у эукариот нет ферментов снимающих АДФ-рибозу с модифицированного фермента. Эта особенность стала основой для действия некоторых токсинов. Например дифтерийный токсин АДФ-рибозилирует рибосому, полностью блокируя ее функции, у клетки человека нет ферментов, удаляющих модифицирующую группу, а следовательно, клетка погибает без возможности запустить биосинтез белка. Холерный токсин необратимо АДФ-рибозилирует аденилатциклазу в цитоплазматической мембране клеток эпителия тонкого кишечника, в результате все процессы всасывания полностью нарушаются.

Изоферменты — это ферменты отличающиеся активностью у одного организма в разных тканях или в ходе онтогенеза а так же у разных особей одного вида.

Изоферменты отличаются как распределением в популяции, так в тканях организма. Также как и изобелки изоферменты могут по разному распределяться как в тканях организма, так и в ходе онтогенеза. Термин «изофермент» («изоэнзим») охватывает все вышеупомянутые физически различимые белки с данной каталитической активностью, однако на практике, и особенно в клинической медицине, его употребляют в более узком смысле, подразумевая физически различимые и поддающиеся разделению формы данного фермента, присутствующие в различных типах клеток данного эукариотического организма, например человека. Изоэнзимы неизменно обнаруживаются в сыворотке и в тканях всех позвоночных, насекомых и в одноклеточных организмах. При этом число ферментов и их содержание сильно варьируют. Известны изоферментные формы дегидрогеназ, оксидаз, трансаминаз, фосфатаз, трансфосфорилаз и протеолитических ферментов. В различных тканях могут находиться разные изоферменты, и эти изоферменты могут иметь неодинаковое сродство к субстратам.

Изоэнзимы лактатдегидрогеназы различаются на уровне четвертичной структуры. Олигомерная молекула лактатдегидрогеназы (мол. масса 130000) состоит из четырех протомеров двух типов, Н и М (оба с мол. массой около 34000). Каталитической активностью обладает только тетрамерная молекула. Если порядок соединения протомеров не имеет значения, то протомеры могут быть скомпонованы пятью способами:

НННН

НННМ

ННММ

НМММ

ММММ

Маркерт подобрал условия для разрушения и реконструкции четвертичной структуры и сумел выяснить взаимоотношения между изоэнзимами лактатдегидрогеназы. Расщепление и реконструкция лактатдегидрогеназ I₁ и I₅ не приводят к образованию новых изоэнзимов. Следовательно, эти два изоэнзима содержат только один тип протомеров. Когда такой же процедуре была подвергнута смесь лактатдегидрогеназ I₁ и I₅, появились также формы I₂, I₃ и I₄. Соотношение изозимов соответствует приведенному ниже субъединичному составу:

I₁— НННН

I₂— НННМ

I₃-ННММ

I₄— НМММ

I₅ -ММММ

Синтез Н- и М-субъединиц детерминируется разными генетическими локусами, и они по-разному экспрессируются в разных тканях (например, в сердечной и скелетной мышцах).

Также примером могут быть изоформы цитохрома Р450, существующего в двух изоформах нормальной и высокоактивной, которая является причиной предрасположенности организма к различным онкозаболеваниям. Чаще всего причиной возникновения изоформ белков являются точечные мутации, не подвергшиеся давлению естественного отбора.