БИОЛОГИЯ Том 2 - руководство по общей биологии - 2004

12. МИКРОБИОЛОГИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ

12.6. Измерение роста бактерий и грибов в культуре

В предыдущем разделе мы проанализировали типичную кривую роста бактерий. Можно ожидать, что такая же кривая характеризует рост дрожжей (одноклеточных грибов) или рост любой культуры микроорганизмов.

При анализе роста бактерий или дрожжей мы можем либо непосредственно подсчитывать число клеток, либо измерять некоторые параметры, зависимые от числа клеток, например мутность раствора или выделение газа. Обычно небольшое количество микроорганизмов засевают в стерильную питательную среду и выращивают культуру в инкубаторе при оптимальной температуре роста. Остальные условия должны быть как можно более близкими к оптимальным (разд. 12.1). Рост следует измерять от момента инокуляции.

Обычно в научных исследованиях придерживаются хорошего правила — проводить эксперимент в нескольких повторах и ставить контрольные пробы, где это можно и нужно. Некоторые методики измерения роста требуют определенного навыка и даже в руках специалистов они не очень точны. Поэтому имеет смысл ставить, если возможно, две пробы (один повтор) в каждом эксперименте. Контрольная проба, в которой к питательной среде не добавляли микроорганизмы, покажет, действительно ли вы работаете стерильно. Имея достаточный опыт, можно в совершенстве овладеть всеми описанными методами, поэтому мы советуем сначала попрактиковаться в них, прежде чем они будут использованы в работе над проектом.

Определить число клеток можно двумя способами, а именно, подсчитывая либо число жизнеспособных клеток, либо общее число клеток. Число жизнеспособных клеток — это число только живых клеток. Общее число клеток — это суммарное число как живых, так и мертвых клеток; обычно этот показатель определить легче.

12.6.1. Число жизнеспособных клеток

Иногда важно знать число жизнеспособных клеток. Например, можно оценить эффективность гибели определенных бактерий при пастеризации молока, измеряя количество жизнеспособных бактерий до и после пастеризации. В промышленном производстве только живые клетки участвуют в процессе, поэтому и здесь важно знать число живых клеток в культуре. Количество жизнеспособных клеток можно подсчитывать на чашках, где культура распределена по поверхности агара или внесена в агар; число жизнеспособных клеток дрожжей можно подсчитывать, используя метод гемоцитометрии.

Посев на поверхность агара

Этот метод был уже описан в разд. 12.4.1 (рис. 12.5). Небольшой известный объем культуры наносят на поверхность питательного агара в чашке Петри. Недостатком этого метода является то, что часть культуры остается на поверхности шпателя и в пипетке, поэтому невозможно подсчитать число клеток с высокой точностью. Однако часто это бывает не важно.

Метод основан на том, что каждая бактерия через определенный период времени, например через два дня, даст одиночную колонию. Таким образом, число бактерий в исходной добавленной пробе равно числу колоний, выросших после инкубации. Невооруженным глазом различимы только колонии, состоящие из 100 000 и более клеток. Обычно колонии содержат несколько миллионов бактерий.

При условии, что проба содержит не слишком много и не слишком мало бактерий, число колоний можно легко подсчитать, причем для предосторожности лучше не открывать крышку чашки Петри при подсчете. Обычно требуется приготовить серии разведений, так чтобы в одной из серий оказалось идеальное число колоний. Серии разведений — это серии последовательных равномерных разбавлений одного образца (рис. 12.9). Когда найдено подходящее разведение, эксперимент повторяют при данном разведении для повышения точности и воспроизводимости результатов. В эксперименте 12.3 из разд. 12.9.2 число бактерий в пробах молока было установлено с использованием этого метода. Некоторые ограничения метода обсуждаются в конце данного раздела.

Рис. 12.9. Приготовление серийных разведений.

Посев заливкой

Этот метод уже был описан в разд. 12.4.1 (рис. 12.6). Принципиально он не отличается от посева на поверхность агара, но в данном случае пробу смешивают с питательным агаром перед заливкой чашек, так что колонии распределяются по всему объему среды, а не растут только по поверхности.

Дрожжи

Подсчет жизнеспособных клеток дрожжей можно проводить с помощью гемоцитометра и метиленового синего. Этот метод более детально описан в следующем разделе.

Проблемы, возникающие при подсчете жизнеспособных клеток

С подсчетом жизнеспособных клеток связан ряд проблем.

1. Некоторые бактерии образуют цепочки или группы клеток, например, стрептококки и стафилококки (рис. 2,10). Каждая группа клеток дает начало только одной колонии. Поэтому иногда результаты подсчета жизнеспособных клеток выражаются не как число бактерий, а как число колониеобразующих единиц.

2. Если присутствует несколько типов бактерий, как, например, в пробах почвы, молока или воды, то условия роста будут не в равной степени благоприятны для каждого типа. Поэтому некоторые бактерии растут гораздо быстрее других, и число видимых колоний будет неадекватно числу бактерий в пробе.